重度子癇前期胎盤組織中Staufen1的表達(dá)及其意義

陳小斌，李媛媛，黃嶺，喬寵

（ 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子癇前期 （preeclampsia，PE） 是孕婦在妊娠期特有的疾病，嚴(yán)重威脅母胎健康。重度子癇前期 （severe preeclampsia，SPE） 及其并發(fā)癥，如胎盤早剝、腦出血、胎兒生長(zhǎng)受限等，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因之一［1］。以孕34周為界，發(fā)病孕周＜34周為早發(fā)型重度子癇前期 （early-onset severe preeclampsia，ESPE），34周后為晚發(fā)型重度子癇前 期 （late-onset severe preeclampsia，LSPE）［2］。SPE病因至今尚不清楚，有學(xué)者［3］認(rèn)為ESPE與滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)不足和子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙有關(guān)；而LSPE與母體血管系統(tǒng)對(duì)妊娠的高敏感性和胎盤動(dòng)脈硬化有關(guān)。MOL等［1］的研究表明，病理性妊娠時(shí)胎盤中某些相關(guān)蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)，引起滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為失常，導(dǎo)致SPE發(fā)生。

Staufen蛋白是JOHNSTON在果蠅中發(fā)現(xiàn)的含有126個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在果蠅胚胎發(fā)育過程中，參與細(xì)胞中mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯，屬于雙鏈RNA結(jié)合蛋白 （double-stranded RNA binding protein，DRBP） 家族。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Staufen 蛋白有2個(gè)同源蛋白，即Staufen1 （STAU1） 和Staufen2，其 中Staufen2蛋 白只在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，而STAU1蛋白在機(jī)體各組織中都有表達(dá)［4］。研究［4-6］表明，STAU1蛋白可以與細(xì)胞中mRNA的3’-非翻譯區(qū) （3’-UTR） 結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解，在細(xì)胞的發(fā)育、分化和凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究［7］表明，STAU1蛋白還參與了胃癌的發(fā)生。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為與腫瘤細(xì)胞行為存在類似性，因此推測(cè)STAU1可能也參與了胎盤組織生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，并參與了SPE發(fā)生的調(diào)控。本研究擬通過檢測(cè)STAU1在SPE胎盤組織中的表達(dá)情況，探討其在PE發(fā)病中的作用，為臨床早期診斷和治療PE提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組

選取2016年5月至2018年4月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院住院剖宮產(chǎn)分娩的SPE孕婦30例作為SPE組，并將其進(jìn)一步分為ESPE組（15例）和LSPE組（15例）；另選同期剖宮產(chǎn)分娩的正常妊娠孕婦30例作為對(duì)照組 （N組） ，其中，孕周與ESPE組相對(duì)應(yīng)者 （EN組） 10例，孕周與LSPE組相對(duì)應(yīng)者 （LN組） 20例。SPE組和N組孕婦均為單胎、剖宮產(chǎn)分娩，排除生殖器官畸形、多胎及其他妊娠相關(guān)合并癥 （如妊娠期糖尿病、原發(fā)性高血壓、慢性腎炎等），其中，EN組常由宮頸機(jī)能不全、胎膜早破、前置胎盤、孕婦合并嚴(yán)重先天性疾病等病因而終止妊娠。

SPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版［2］。本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （倫理批號(hào)：2017PS230K），符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定，所有參加研究的孕婦及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集：取剖宮產(chǎn)分娩后的無菌胎盤組織 （在胎盤母體面距離臍帶附著處2～3 cm范圍取材，避開機(jī)化灶、鈣化灶、出血灶等），用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗，分割成1 cm×1 cm×1 cm組織塊，保存于液氮，用于提取RNA和蛋白質(zhì)。另取1 cm×1 cm×1 cm組織塊，4%多聚甲醛保存，行石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （real-time PCR，RT-PCR）：取約50 mg胎盤組織，采用RNA iso試劑盒 （日本TaKa-Ra公司） 提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度，采用5X-ALL-In-One RT MasterMix試劑盒 （加拿大abm公司） 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。行PCR，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，分析溶解曲線及循環(huán)閾值 （cycle threshold，Ct），每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。采用2-△△Ct法計(jì)算STAU1 mRNA經(jīng)內(nèi)參18S RNA標(biāo)化后的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Western blotting：取約50 mg胎盤組織，提取蛋白質(zhì)，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，變性后保存于-20 ℃。行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入兔抗人STAU1多克隆抗體 （1︰500稀釋，美國 Signalway公司） 和兔抗人GAPDH多克隆抗體 （1︰1 000稀釋，杭州賢至生物科技有限公司），4 ℃過夜。復(fù)溫30 min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體 （1︰5 000稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司） 孵育2 h。ECL顯色，應(yīng)用Biosystems azure C300成像系統(tǒng)采集圖像并分析。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)：取4%多聚甲醛固定后的胎盤組織，石蠟包埋48 h后，制石蠟切片，厚3～4 μm。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒 （中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 ） 行免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)脫蠟、封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)7 min，封閉非特異性抗原/電荷45 min，加入一抗 （STAU1 1︰200稀釋） ，4 ℃孵育10～12 h，二抗 （生物素標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG） 孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染核3～5 min，棕黃色為陽性。應(yīng)用NIS-Elements軟件 （日本Nikon公司） 對(duì)圖像進(jìn)行采集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本資料

ESPE組和EN組及LSPE組和LN組患者的年齡、孕周間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05），而ESPE組和LSPE組的收縮壓、舒張壓及24 h尿蛋白定量均顯著高于同期妊娠對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.001）。見表2。

2.2 胎盤組織中STAU1 mRNA的表達(dá)情況

表2 患者的基本資料Tab.2 Basic data of patients

SPE組胎盤組織中STAU1 mRNA的表達(dá)水平 （0.844±0.074） 顯著低于N組 （1.096±0.057），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01）；其中，ESPE組胎盤組織中STAU1 mRNA的表達(dá)水平 （0.683±0.061） 顯著低于EN組 （1.015±0.060），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01），而LSPE組胎盤組織STAU1 mRNA表達(dá)水平 （1.005±0.124） 與LN組 （1.136±0.080） 比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05），見圖1。

2.3 胎盤組織中STAU1蛋白的表達(dá)情況

SPE組胎盤組織中STAU1蛋白的表達(dá)水平 （0.916±0.102） 顯著低于N組 （1.573±0.135），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.001）；其中，ESPE組胎盤組織中STAU1蛋白表達(dá)水平 （0.719±0.101） 顯著低于EN組 （2.025±0.155），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.001），而LSPE組胎盤組織STAU1蛋白表達(dá)水平 （1.112±0.165） 與LN組 （1.337±0.165） 比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05），見圖2。

圖1 胎盤組織中STAU1 mRNA表達(dá)水平Fig.1 STAU1 mRNA expression levels in different placental tissues

2.4 胎盤組織中STAU1蛋白的表達(dá)定位情況

圖2 胎盤組織中STAU1蛋白表達(dá)水平Fig.2 STAU1 protein expression levels in different placental tissues

4組胎盤組織的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞中均有STAU1蛋白的表達(dá)，且主要在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其中ESPE組STAU1蛋白表達(dá)水平顯著低于EN組 （0.014±0.008 vs 0.019±0.002，P ＜ 0.001），LSPE組與LN組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （0.011±0.001 vs 0.012±0.003，P ＞ 0.05），見圖3。

3 討論

PE是指妊娠20周后孕婦出現(xiàn)高血壓并存在多器官及系統(tǒng)受累，嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒健康，尤其SPE及其嚴(yán)重的并發(fā)癥是導(dǎo)致母嬰死亡的重要原因。研究［1］發(fā)現(xiàn)PE存在多因素、多機(jī)制、多通路發(fā)病機(jī)制，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不明確。在妊娠早期，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞促使子宮螺旋動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)，擬合并替代胎盤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分血管平滑肌，使子宮螺旋小動(dòng)脈從高排低阻狀態(tài)變成低排高阻狀態(tài)，建立有效的母體和胎兒之間的營養(yǎng)物質(zhì)交換，維持母體正常妊娠及胎兒的正常發(fā)育。同時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)行為受到時(shí)間和空間的嚴(yán)格調(diào)控，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過淺可能會(huì)導(dǎo)致PE的發(fā)生［8］。目前，研究［3，9］發(fā)現(xiàn)多種基因參與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的調(diào)控，如TINP-1、KIR2DL1、MMPs等。

圖3 胎盤組織中STAU1蛋白的表達(dá)定位Fig.3 Localization of STAU1 protein in different placental tissues

STAU1蛋白是一種含有多個(gè)雙鏈RNA的RNA結(jié)合蛋白［10］。SUGIMOTO等［11］研究發(fā)現(xiàn)，STAU1蛋白具有mRNA和長(zhǎng)非編碼RNA的結(jié)合區(qū)域，能分別與其3’-UTR和5’-UTR端結(jié)合，參與mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、局部翻譯和RNA代謝、加工等生物學(xué)功能［12］。BONNET-MAGNAVAL等［13］研 究 發(fā) 現(xiàn)，STAU1還 是一種應(yīng)激反應(yīng)基因，正常生理情況下，STAU1 mRNA可以與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) （internal ribosome entry sites，IRES） 相結(jié)合，啟動(dòng)編碼細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中抗氧化蛋白mRNA的翻譯，使細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。KRETZ等［6］研究發(fā)現(xiàn)，STAU1可與LncRNA相結(jié)合，并在人表皮細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。SAKURAI等［14］研究發(fā)現(xiàn)，敲低STAU1能夠恢復(fù)ADAR1敲低引起的應(yīng)激細(xì)胞凋亡，在胃癌細(xì)胞中，STAU1可與CDKN2B mRNA的3’-UTR結(jié)合，降解CDKN2B，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［7］。提示STAU1在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，而目前尚無關(guān)于STAU1在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)SPE影響的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，STAU1 mRNA和蛋白在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)，其中以合體滋養(yǎng)細(xì)胞為主；通過比較發(fā)現(xiàn)，SPE組 （ESPE組和LSPE組） STAU1 mRNA和蛋白的表達(dá)均低于N組，表明STAU1很有可能參與了SPE的發(fā)病機(jī)制，其中STAU1 mRNA和蛋白在ESPE組的表達(dá)低于EN組，提示STAU1可能與子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄障礙有關(guān)，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)能力不足，從而參與PE的發(fā)病；而LSPE組STAU1 mRNA和蛋白的表達(dá)與LN組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是由于LSPE的發(fā)生主要與內(nèi)皮細(xì)胞損傷及胎盤動(dòng)脈硬化、全身系統(tǒng)性免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)［15］，進(jìn)一步說明STAU1蛋白可能在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)行為中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，STAU1的表達(dá)水平可能與SPE的發(fā)病有關(guān)，尤其與ESPE的發(fā)生相關(guān)。