TGF-β1對UVB輻射誘導人角質形成細胞m iRNA和環氧合酶-2表達的影響及機制

李玉文，李 辰，封江彬，范 莉，劉建香，劉青杰，田 梅*

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088)

紫外(ultraviolet，UV)線電磁輻射，根據波長分為UVA(315～400 nm)、 UVB(280～315 nm)和 UVC(190～280 nm)，UV線能對人體健康產生不良效應，可導致DNA損傷、炎癥、免疫抑制、光老化、基因突變和皮膚癌。目前，世界癌癥研究協會已將紫外線(UVA和UVB)列為1類致癌源[1]。UVB對皮膚的損傷作用最強，研究表明，過量的UVB照射是皮膚癌的主要危險因素[2]。

角質形成細胞是人體抵御紫外線輻射的第一道防線，不僅是機體的保護細胞，而且參與各種細胞生物學過程，如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉化等[3-5]。有研究發現紫外線照射可誘導人角質形成細胞產生大量的 轉 化 生 長 因 子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)[6-7]。TGF-β可以調節細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程，與皮膚炎癥和皮膚癌的進展密切相關[9]。因此，研究TGF-β在UVB誘導的皮膚損傷、炎癥及皮膚癌中的作用機制，可以為預防與治療紫外誘發皮膚腫瘤尋找新的生物靶點。

miRNA芯片研究發現，紫外線誘導皮膚細胞某些miRNA的表達變化可能與輻射后TGF-β1通路的表達和調控有關，可能在UV引起的致癌過程中發揮作用[9]，TGF-β1是調控UV輻射誘導miRNA表達的重要的節點分子之一，這些miRNA包括let-7c，miR-23a、b，miR-139-6p等，其中miR-23a的表達與腫瘤生長、侵襲及血管生成有關。let-7c是let-7基因家族中的一員，在細胞生長、增殖等方面具有重要作用，與關鍵的原癌基因直接相關。

環氧合酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸轉變為前列腺素的限速酶，與炎癥、癌癥和其他許多病理過程密切相關。高劑量紫外線照射能夠誘導皮膚中COX-2的上調表達，在UVB長期照射以及UVB所引發的鱗狀細胞癌中COX-2的表達也顯著增高[10-11]，在皮膚癌的發生中起重要作用。

本研究利用UVB照射TGF-β1處理的人角質形成細胞(HaCaT)，檢測細胞中敏感的與多種人惡性腫瘤密切相關的miRNA-23a和let-7c兩種miRNA及炎癥反應蛋白COX-2通路相關蛋白的表達變化，探討TGF-β1與紫外輻射誘導的細胞損傷、炎癥反應、腫瘤發生等的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清購自Gibco公司；MEM培養基購自康寧公司；TGF-β1購自CST公司；Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；TaqMan microRNA反轉錄試劑盒、miRNA引物和探針以及TaqMan Gene Expression Master Mix實時熒光定量PCR試劑盒均購自Applied Biosystems公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo公司；β-actin、COX-2、caspase-3抗體均購自CST公司；HRP標記的山羊抗兔和抗鼠二抗購自中杉金橋公司。

1.2 細胞培養與細胞照射

HaCaT細胞購自北京協和醫院細胞庫，將細胞接種于含有10%胎牛血清的MEM培養基中，在37℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中進行培養。

紫外照射是利用Ultra-Violet Products公司的CL-1000系統，UVB波長為302 nm，輻照度為55.5 W/m2，照射距離約為15 cm，照射劑量依據本所輻射防護研究室TN-2340紫外線強度劑量校準。將細胞培養皿放入儀器內，照射一定時間后取出。研究量效關系時選取10、20、30 mJ/cm2的UVB；研究時效關系時選擇30 mJ/cm2的UVB。

1.3 細胞分組

對照組細胞采用常規培養基培養；處理組細胞是將 3 μL 的 TGF-β1(濃度為 10 ng/μL)加入到 3 mL HaCaT細胞培養基中，TGF-β1的終濃度為10 ng/mL，作用48 h后再進行轉錄水平和翻譯水平的實驗。

研究轉錄水平的表達時，采用10、20、30 mJ/cm2的UVB分別照射對照組和處理組細胞，于照后6 h檢測兩組細胞中miR-23a和let-7c的表達變化；采用30 m J/cm2的UVB分別照射對照組和處理組細胞，于照后4、12和24 h檢測照后不同時間對兩組細胞中miR-23a和let-7c表達變化的影響。

研究翻譯水平的表達時，利用30 mJ/cm2的UVB分別照射對照組和處理組細胞，于照后不同時間(0、2、4、8、12、24和48 h)檢測兩組細胞中COX-2和凋亡執行分子caspase-3蛋白表達的變化。

1.4 實時熒光定量PCR檢測m iR-23a和let-7c表達水平

使用Trizol試劑盒提取各組細胞RNA。利用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒合成cDNA，反應總體積為7.5μL，其中RNA樣本量為2.5μL(12.5 ng/μL)，反應條件為16℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min。利用TaqMan Gene Expression Master Mix實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，反應總體積為12μL，其中反轉錄產物為0.9μL，每個樣品設置3個平行樣，每組實驗重復3次。反應條件為：95℃預變性10 min，95℃、15 s，60℃、1 min，45個循環。HaCaT細胞的miRNA-23a和let-7c表達水平以U6為內參，利用Applied Biosystems 7500 Sequence Detection Software軟件，依據相對定量的2-ΔCT法進行結果分析。

1.3 Western blot檢測COX-2和caspase-3蛋白表達水平

收集各組細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解提取總蛋白，并采用BCA法進行蛋白定量。配制12%的分離膠和4%積層膠進行SDS-PAGE電泳(恒壓100 V)，蛋白上樣量為30μg，后將蛋白電轉至PVDF膜(恒壓100 V，1.5 h)，加入5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，依據說明書分別加入COX-2和caspase-3的一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；再分別加入相應的HRP標記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育60 min，TBST洗滌3次，每次20 min，加入ECL化學發光試劑，顯影并成像。利用Image J軟件對COX-2蛋白條帶進行灰度分析。

1.4 統計學分析

應用SPSS 20.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(xˉ±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較用Bonferroni校正的f檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 TGF-β1對照后m iR-23a和let-7c表達的影響

實時熒光定量PCR檢測各組細胞miR-23a的相對表達水平，結果如圖1所示，對照組細胞經10和30 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達未見明顯變化；20 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達略有升高。30 mJ/cm2的UVB照射后12 h和24 h，對照組miR-23a的表達增強(P均＜0.05)。結果表明當一定能量的UVB照射一段時間后可以誘導正常HaCaT細胞中miR-23a的表達上調。

處理組細胞經10、20、30 m J/cm2的UVB照射后6 h，miR-23a的表達均升高(P均＜0.05)，且與同一照射劑量的對照組相比，處理組miR-23a的表達均顯著增強(P均＜0.05)；30 m J/cm2的UVB照射后不同時點，處理組miR-23a的表達均增強(P均＜0.05)，在照后12 h時表達上調最顯著；且與同一時點的對照組相比，處理組miR-23a的表達均明顯增強(P均＜0.05)，說明TGF-β1可促進受照細胞中miR-23a的表達水平。然而，未受照的處理組細胞中miR-23a的表達無明顯變化，說明TGF-β1作用于HaCaT細胞48 h，不能誘導未受照細胞中miR-23a的表達上調。此外，結合A、B兩圖可以看出，對照組細胞在30 mJ/cm2的UVB照射后6 h，未見miR-23a的表達明顯增強，而處理組細胞在30 m J/cm2的UVB照射后0 h即出現顯著的miR-23a表達上調，進一步說明TGF-β1可對受照HaCaT細胞中miR-23a的表達起到促進作用。

圖1 實時熒光定量PCR檢測m i-23a的表達變化情況

實時熒光定量PCR檢測各組細胞let-7c的相對表達水平，結果如圖2所示，20和30 m J/cm2的UVB照射后6 h，對照組細胞中let-7c的表達顯著升高(P均＜0.05)，且30 m J/cm2的UVB照射后不同時點，對照組let-7c的表達均明顯上升(P均＜0.05)，可以看出，UVB照射可促進正常HaCaT細胞中let-7c的表達。

與同一受照劑量的對照組相比，處理組未受照細胞與受10 mJ/cm2UVB照射的細胞內let-7c表達明顯升高(P均＜0.05)，而20和30 m J/cm2UVB照射后，處理組let-7c表達明顯下調(P均＜0.05)。30 mJ/cm2的UVB照射后4、12和24 h，處理組細胞let-7c的表達與同一時點的對照組相比，均有所降低(P均＜0.05)，提示TGF-β1可在一定范圍內抑制受照HaCaT細胞的let-7c表達。

2.2 TGF-β1對照后COX-2和Caspase-3表達的影響

圖2 實時熒光定量PCR檢測let-7c的表達變化情況

Western blot檢測HaCaT細胞中COX-2的蛋白表達水平，結果如圖3所示，未受照和照射后0 h的對照組細胞中COX-2不表達，自照射后2 h開始，對照組細胞中出現COX-2的蛋白表達，說明UVB照射一段時間后可以誘導正常HaCaT細胞中COX-2的表達；而處理組細胞在UVB照射前后，COX-2蛋白均表達，尤其是照射后12、24和48 h，COX-2的表達較照射后0 h組明顯增強(P均＜0.05)，照后同一時點內，處理組較對照組COX-2表達均顯著上調(P均＜0.05)，提示TGF-β1和UVB均可誘導HaCaT細胞中COX-2的表達，而TGF-β1預先作用于細胞后，可使受照細胞中COX-2的表達水平上調更為明顯。

圖3 30 m J/cm2 UVB照射后不同時間COX-2蛋白的表達變化

Western blot檢測HaCaT細胞中caspase-3的蛋白表達水平，結果如圖4所示：對照組細胞經UVB照射后2、12、24和48 h，活化的caspase-3亞基表達顯著增加，特別是照射后12 h開始caspase-3的活化明顯增強，并一直持續至48 h；而處理組細胞受照后，活化的caspase-3亞基在照射后12 h時增加明顯，而后隨時間延長而明顯減少，提示TGF-β1預先作用于HaCaT細胞，可抑制caspase-3亞基的活化。

圖4 30 m J/cm2 UVB照射后不同時間caspase-3蛋白的表達變化

3 討論

紫外線可致癌，其中UVB致癌性最強，曬紅及曬傷作用為UVA的1 000倍。由于紫外線照射不能穿透人體皮膚，因此表皮層是紫外線誘導的損傷和致癌的主要部位[9]。正常情況下，受損細胞可通過自身修復或誘導細胞凋亡來應對損傷，若受損細胞未能及時修復可導致腫瘤細胞的形成[12]。

有研究報導紫外線照射可誘導角質形成細胞產生大量的TGF-β[6]。眾所周知，TGF-β在調節多種生物學事件中表現出雙重作用，如細胞增殖和分化、血管生成、炎癥和免疫應答以及癌癥。在皮膚癌早期，TGF-β是角質形成細胞的有效生長抑制劑，對腫瘤起抑制作用；而到晚期，TGF-β失去對癌細胞生長抑制，且TGF-β誘導的皮膚炎癥有利于皮膚癌進展和轉移[13]。TGF-β的細胞和分子功能的復雜性使得其在組織穩態、疾病發展和腫瘤發生中的作用變得復雜。

本研究在前期建立紫外輻射模型的基礎上，利用TGF-β1預先對HaCaT細胞進行干預，檢測UVB照射后輻射敏感的腫瘤相關miRNA-23a、let-7c的表達水平，分析炎癥相關蛋白COX-2、凋亡執行分子caspase-3的表達變化，探討TGF-β1在UVB誘導的皮膚細胞輻射損傷中的作用及機制。

miRNA是一類廣泛參與細胞重要生命過程的小分子RNA，已被公認為是參與人類腫瘤發生的一類新基因[14]，在皮膚癌的發生、侵襲和轉移中起重要作用[15]。Kraemer[9]等利用miRNA芯片和生物信息學分析發現，TGF-β1是調控UV輻射誘導miRNA表達的重要的節點分子之一，這些miRNA包括let-7c，miR-23a、b，miR-139-6p等，其中miR-23a的表達與腫瘤生長、侵襲及血管生成有關，可調節UV誘導的光化學產物環丁烷嘧啶二聚體(CPD)的清除、抗凋亡和端粒酶1/Caspase-7/STK4表達[16]。在對HaCaT細胞的研究中發現，miR-23a是一種光保護性miRNA，過表達的miR-23a可以通過抑制幾個下游靶標來減輕UVB誘導的角質形成細胞損傷[16]。let-7c是let-7基因家族中的一員，在細胞生長、增殖等方面具有重要作用。研究發現，let-7能直接調節細胞周期關鍵的原癌基因，阻斷細胞G1/S期的轉換過程，從而抑制腫瘤細胞增殖，具有抑癌基因樣作用[17]。此外，研究證實，let-7可通過調控高遷移率族蛋白A2(HMGA2)而抑制多種腫瘤的EMT過程[18-20]。

本研究發現，TGF-β1可誘導經UVB照射的HaCaT細胞中miR-23a的表達上調，與相關研究結果一致[16]。對于let-7c蛋白，則表現為在未受照細胞及較低劑量UVB照射細胞中let-7c表達增加，而在較高劑量UVB照射細胞中，let-7c的表達明顯受到抑制，提示TGF-β1可能通過調節miR-23a和let-7c的表達進而影響HaCaT細胞損傷的修復、CPD清除、抗凋亡甚至腫瘤細胞的產生等，但這種作用與受照劑量有關，TGF-β1對較高劑量UVB照射產生的損傷可能會有不同的作用和機制，有待進一步深入研究。

環氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(prostaglandins，PG)在合成過程中的重要限速酶。目前發現的亞型有3種：COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是可在細胞因子、激素、致癌物質、生長因子、紫外線等多種誘導因子的刺激下快速表達的誘導型酶，正常細胞中不表達。研究發現，COX-2不僅廣泛參與機體炎癥等多種病理生理過程，而且參與多種腫瘤的發生和發展。COX-2在UV誘導的炎癥反應和腫瘤發生過程中發揮重要作用[21]，炎癥過程通過釋放各種炎性因子促進表皮過度增殖和增生，進而導致皮膚癌[10]。研究證實非甾體抗炎藥和選擇性COX-2的抑制劑可以降低皮膚癌的發生[22]，目前COX-2已成為腫瘤預防與治療的新的生物靶點。

本研究結果發現，TGF-β1預先作用于HaCaT細胞后，COX-2的表達水平明顯增加，而對凋亡執行分子caspase-3的檢測發現：對照組細胞經UVB照射后不同時點，活化的caspase-3亞基表達均顯著增加，特別是照射后12 h開始，表達增強更為明顯，與我們前期觀察到的凋亡結果相符[23]；而處理組細胞受照后，活化的caspase-3亞基自照后24 h開始明顯減少，可能與TGF-β1誘導COX-2表達增加有關，有研究表明COX-2蛋白的過度表達可促進腫瘤細胞過度增殖，抑制caspase-3的表達[24]，從而使細胞增殖和凋亡之間的平衡失調，促進腫瘤惡性行為的發生。

通過本研究結果可以發現，TGF-β可以調控多個基因/蛋白的表達，作為UVB輻射誘導miRNA表達的關鍵調控分子，其調節的miR-23a在一定UVB照射劑量范圍內的高表達一方面可通過清除CPD保護受照細胞，增強HaCaT的細胞抗性；另一方面又因其抗凋亡作用而不利于細胞的損傷修復。TGF-β對let-7c的作用則可能導致let-7c的抑癌基因樣作用減弱，有發生皮膚腫瘤的風險。TGF-β誘導COX-2在UVB輻射后的高表達可以增加受照皮膚的炎癥反應和損傷細胞的抗凋亡作用，Allen Guanqun Li等甚至認為在皮膚癌發生的早期階段，TGF-β1誘導的皮膚炎癥可能超越了TGF-β1腫瘤抑制作用[13]。

TGF-β1對于UVB誘導的細胞輻射損傷的作用機制非常復雜，明確TGF-β調控的生物因子的作用及與其他信號通路之間的關系對于UVB誘導的皮膚疾病的預防與治療十分重要。本研究針對的是在一定劑量范圍UVB的單次短時照射及TGF-β1的影響，以后還需進一步模擬人體長期紫外暴露深入探討紫外輻射損傷及致癌作用。