膠質母細胞瘤分子標志物的研究進展

余明辰，吳 楠，孫冬琳，金 焰*

(哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學研究室，黑龍江 哈爾濱 150081)

神經膠質瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其中膠質母細胞瘤占整個腦膠質瘤比例的60%以上。膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的、惡性程度最高的原發(fā)顱內腫瘤，約占40%～60%。膠質母細胞瘤呈現(xiàn)的高侵襲性、高增殖性等高度惡性生物學行為嚴重限制著腫瘤患者的總生存期[1]。目前認為膠質母細胞瘤尚無法治愈，常用的積極治療方法包括最大安全范圍手術切除、輔助放療以及同時輔助替莫唑胺治療。即便如此，在這種積極的組合治療后，患者的中位生存期仍僅為15個月[2]。本文將對膠質母細胞瘤中主要臨床相關的遺傳學和表觀遺傳學異常，如IDH1/2、EGFR、PDGFRA和NF1等基因的突變、MGMT基因啟動子甲基化改變、hTERT啟動子突變及相關長鏈非編碼RNA進行闡述。這些標志物對進一步完善膠質母細胞瘤的分類、提高診斷的準確性、判斷患者的預后水平、未來研發(fā)有效的分子靶向治療藥物有重要的參考意義。

1 膠質母細胞瘤的分子分型

腦膠質瘤在國際上常用的病理分型為世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)制定的分級系統(tǒng)，分為I級(惡性程度最低、預后最好)到IV級(惡性程度最高、預后最差)，其中膠質母細胞瘤對應WHOIV級膠質瘤。膠質母細胞瘤主要分為兩大類，即“原發(fā)性”和“繼發(fā)性”。原發(fā)性膠質母細胞瘤通常出現(xiàn)在沒有已知的臨床癌前病變的情況下，而繼發(fā)性膠質母細胞瘤是較低級別的膠質瘤隨著時間推移由于分子進展和惡性程度增加而形成的。

近年來，研究人員利用高通量基因組、表觀遺傳基因組、轉錄組學方法對膠質瘤進行了詳細的分子表征分析，識別出了特異性和高度重復的分子改變，并對膠質瘤的分類引入新的概念。2010年，Verhaak等人根據(jù)美國癌癥基因組圖譜計劃(The CancerGenomeAtlas，TCGA)中腦膠質瘤基因轉錄組進行研究分析，將膠質母細胞瘤分為4種亞型：前神經元型(proneural)、神經元型(neural)、經典型(classical)、間質型(mesenchymal)[3](圖1)。其中，前神經元型、經典型、間質型腫瘤大量富集EGFR、PDGFRA、IDH1/2和NF1基因的突變。經典型以EGFR基因擴增/突變?yōu)樘卣?。前神經元型主要表現(xiàn)為PDGFRA突變或IDH1/2突變，基于與IDH1/2突變狀態(tài)直接相關的特征性DNA甲基化模式，前神經元型膠質母細胞瘤被進一步細分為膠質瘤CpG(glioma-CpGislandmethylatorphenotype，G-CIMP)陽性和陰性亞組[4]。間質型主要存在神經纖維蛋白1(neurofibromatosis type1，NF1)突變，間質型的特征主要受轉錄因子信號轉導和轉錄激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription 3，STAT3)，CCAAT/增強子結合蛋白-β(C/EBPβ)和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(transcriptionalcoactivatorwith PDZ-bindingmotif，TAZ)表達水平的調控，這些因子也與不良的臨床預后有關[5-6]。此外，最近的研究表明，CTNND2(編碼catenin-δ2)和RHPN2分別作為間質型轉化的陰性和陽性遺傳調節(jié)因子發(fā)揮作用[6-7]。

圖1 膠質母細胞瘤分子分型[3]

許多研究組正在研究前神經元型和間質型的特征以及膠質母細胞瘤的其他轉錄亞型是否可作為患者預后的預測指標。雖然前神經元型整體上傾向與更好的預后相關，但更進一步的研究表明，前神經元型膠質母細胞瘤可以細分為IDH1/2突變的G-CIMP陽性和陰性亞組，并且一旦IDH1/2和G-CIMP均未突變，前神經元型與其他IDH1/2野生型膠質母細胞瘤相比惡性程度和患者預后均無較大差別[8]。

2 膠質母細胞瘤中臨床相關的遺傳和表觀遺傳學異常

2.1 異檸檬酸脫氫酶1和2(IDH1/2)基因突變

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環(huán)中重要催化酶，包含IDH1、IDH2、IDH3三種同工酶。在三羧酸循環(huán)中，IDH將異檸檬酸氧化脫羧產生α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH，為細胞的正常代謝和生物合成提供必要的原料。

在膠質瘤中，IDH1基因突變主要發(fā)生在R132，IDH2基因突變發(fā)生在R172，突變將導致該位點密碼子被其他氨基酸殘基取代[9]，造成蛋白酶功能的改變。突變后的IDH將消耗α-酮戊二酸、NADPH并催化產生致癌代謝物2-羥基戊二酸(2-HG)使其大量積聚最終促進膠質瘤的發(fā)生發(fā)展[10-14]。

約60%～80%的Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤和高達90%繼發(fā)性膠質母細胞瘤中發(fā)生IDH1/2基因突變。其中IDH1-R132H位點的突變頻率最高，約占95%左右，IDH2突變頻率較低。IDH基因突變較多發(fā)于青年患者。但在膠質瘤患者的預后評價方面，IDH突變的出現(xiàn)也通常意味著患者有更長的總生存期和無進展生存期[12，15]。有研究顯示，與野生型相比IDH基因突變可以增強膠質瘤細胞對化療藥物敏感性[16-17]。

2.2 表皮生長因子受體異常激活

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子細胞增殖和信號轉導的酪氨酸激酶型受體，該基因定位于7號常染色體p12，所編碼的蛋白包含3個結構域：胞外配體結合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內激酶區(qū)。當EGFR經其配體活化后，可形成二聚體導致其胞外的構象變化，并激活胞內區(qū)酪氨酸激酶使其殘基磷酸化，這種自身磷酸化可以激活下游信號通路的磷酸化，如MAPK，Akt和JNK通路，最終促進了腫瘤發(fā)生的一系列生物學行為，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲和轉移等。

約40%的原發(fā)性膠質母細胞瘤中攜帶EGFR基因的擴增[18-20]，其中，約50%EGFR擴增的膠質母細胞瘤在該基因中存在組成型活性變體EGFRvIII突變，這種突變通常與腫瘤生長和更差的臨床療效有關。EGFRvIII突變涉及基因重排，通過框內缺失編碼該蛋白的部分胞外結構域的外顯子2-7而產生[21-23]一個新的甘氨酸，這使得EGFRvIII缺失了胞外配體結合區(qū)的267個氨基酸位點，致使其激活不依賴傳統(tǒng)的受體配體結合。

有研究表示在膠質瘤細胞中EGFRvIII的異位過表達可誘導致瘤性、細胞增殖、導致相關下游通路的激活，如PI3K/AKT信號通路，還可通過調節(jié)Bcl-XL基因表達來抵抗細胞凋亡等惡性生物學行為[24]。目前，EGFRvIII的缺失突變可用作免疫原性腫瘤特異性靶點的新型肽序列，用于開發(fā)基于肽段的疫苗接種治療方法。

2.3 血小板源性生長因子受體異常激活

血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)為血小板源性生長因子(PDGF)蛋白質家族的受體，是一種位于細胞膜表面的酪氨酸激酶受體，參與細胞的趨化、分裂和增殖。血小板源性生長因子及其受體的異常激活和表達可導致腫瘤新生血管形成，促進腫瘤細胞增殖和遷移。

在30%的人神經膠質瘤中，有與PDGFR信號傳導相關的基因表達。在15%的膠質母細胞瘤的中發(fā)現(xiàn)α型PDGFR(PDGFRA)基因的擴增，其為膠質母細胞瘤的前神經元亞型的特征性標志[3，25]，并且約40%攜帶基因擴增的膠質母細胞瘤含有該基因的內部缺失，并將這種缺失稱為PDGFRAΔ8，9[26]。PDGFRAΔ8，9由含有243個堿基對的外顯子8和9的框內缺失導致細胞外結構域截短產生，該缺失可能與PDGFRA的激活有關[27]。除了這種最常見缺失之外，還可檢測到PDGFRA的胞內結構域和KDR/VEGFR-2的胞外結構域可發(fā)生框內基因融合，以及出現(xiàn)較少的PDGFRA點突變[28]。類似于EGFR和EGFRvIII，PDGF和PDGFR的擴增可能促進了侵襲性膠質瘤生長。Assanah等[29-30]研究表明，用表達PDGF的逆轉錄病毒轉導新生大鼠側腦室視管膜下層的細胞可產生類似膠質母細胞瘤的大的彌散性腫瘤。他們發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤中，PDGF表達通過自分泌和旁分泌信號傳導機制誘導腫瘤形成，從而推動異質性惡性膠質瘤的進化。

2.4 1型神經纖維瘤病基因異常

TCGA高通量測序分析表明，在約14%～23%的膠質瘤樣本中1型神經纖維瘤病基因(neurofibromatosis type 1，NF1)通過遺傳缺失或突變而失活。NF1突變是間質型膠質母細胞瘤最常見的遺傳變異，約占51%，并提示更差的患者預后[3，31]。NF1基因突變導致其mRNA翻譯提前終止，最終影響NF1蛋白功能。NF1是重要的負向調控星形膠質細胞瘤中Ras和MTOR信號通路的腫瘤抑制因子，表達下降或突變會促進腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展。利用NF1缺陷型原代小鼠誘導的原位膠質瘤模型，揭示了NF1的缺失導致細胞增殖和遷移增強，并發(fā)現(xiàn)該惡性表型依賴于RAS信號傳導介導的MTOR的過度激活。并且這種情況下MTOR不依賴于延伸因子4E結合蛋白1(4EBP-1)/S6激酶誘導的雷帕霉素敏感的Rac1 GTPase激活[21]。而STAT3是NF1的另一個下游靶點，以MTORC1和Rac1依賴性方式調節(jié)并增加細胞周期蛋白D1的表達[32]。此外。有研究表明NF1促進了小兒腦膠質瘤的惡性進展，并且這種惡性表型受到雌性激素的調節(jié)[33]。

2.5 O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶啟動子區(qū)甲基化

O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)基因是膠質瘤中重要的耐藥基因，位于10號染色體q26位點，所編碼的蛋白是一種DNA修復酶，該酶從O-6-甲基鳥嘌呤還原鳥嘌呤的能力可調節(jié)對烷化劑敏感性。替莫唑胺是膠質母細胞瘤臨床上的一線化療藥物，為咪唑并四嗪類具有抗腫瘤活性的烷化劑。O-6-甲基鳥嘌呤是一種由化療藥物如替莫唑胺的烷化劑誘導產生的基因組損傷產物。在膠質母細胞瘤中，特定基因座上幾個基因的啟動子被高甲基化，并且經常導致腫瘤抑制基因的表達改變，例如細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)，RB1，PTEN和TP53等[34-37]。膠質母細胞瘤在臨床上最重要的DNA甲基化標志物之一是MGMT的啟動子，其在大約40%的原發(fā)性膠質母細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)并且與MGMT基因的轉錄沉默相關，證明MGMT啟動子的高甲基化可作為膠質母細胞瘤烷基化化療的預測指標[38-39]。許多臨床試驗和隊列研究顯示MGMT基因的啟動子甲基化與用烷化劑治療患者的無進展生存期和總生存期延長相關[38，40-42]。

2.6 人類端粒酶逆轉錄酶啟動子突變

人類端粒酶是一種核糖核蛋白，可調控染色體末端的端粒DNA長度，在細胞永生化和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。癌癥的標志之一是端粒維持機制的異常調控，該過程受端粒酶的調節(jié)，在90%的晚期癌癥中端粒酶都有活性。人類端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是端粒酶復合物的催化亞基，其表達與大多數(shù)腫瘤如乳腺癌，肉瘤和腦腫瘤的預后不良有關[43-46]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TERT啟動子突變在多種癌癥類型中頻繁出現(xiàn)，包括黑色素瘤、脂肪肉瘤、膀胱癌和神經膠質瘤[47-49]。有趣的是，膠質瘤的基因組分析顯示，TERT啟動子突變發(fā)生在70%～80%的原發(fā)性膠質母細胞瘤和70%以上的少突膠質細胞瘤中，但在IDH1/2突變彌漫性和間變性星形細胞瘤以及IDH1/2突變發(fā)生較少而攜帶高頻的ATRX突變的(繼發(fā)性)膠質母細胞瘤中較少發(fā)生[50-51]。TERT啟動子突變在兒童膠質母細胞瘤中也很少見，其特征在于組蛋白H3.3(H3F3A)突變，其通常與TP53和ATRX/DAXX突變相關[52]。一般來說，TERT啟動子突變并攜帶IDH1/2野生型的膠質母細胞瘤的總生存期較差。TERT啟動子突變分析可作為原發(fā)性膠質母細胞瘤患者的一種新型預后指標，TERT啟動子突變，EGFR擴增和IDH1/2突變等的聯(lián)合分析為鑒定膠質瘤分子分型和預后作出重要判斷[49]。

2.7 BRAF突變

B-Raf原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf protooncogene，serine/threonine kinase，BRAF)基因位于人染色體7q34，是MAPK信號通路重要的轉導因子，主要借助有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來行使其功能，參與細胞內多種生物學事件。在BRAF密碼子600處激活錯義突變在幾種神經上皮腫瘤中很常見，其中最常見的是V600E突變。在膠質母細胞瘤中，大約5%的病例檢測到BRAF V600E突變[53-54]。具有上皮分化組織學特征的膠質母細胞瘤中報道了BRAF突變的頻率增高，即“上皮性膠質母細胞瘤”，其優(yōu)先在兒童和年輕成人中表現(xiàn)出，并且在超過50%的病例中攜帶BRAF V600E突變[55]。然而用索拉非尼——一種靶向BRAF，VEGFR，PDGFR和c-KIT的多激酶抑制劑治療兒童低級星形膠質細胞瘤患者，卻導致了腫瘤生長的意外加速，甚至在BRAF突變腫瘤患者中也出現(xiàn)了這種情況[56]。但在一個2014年的病例顯示用BRAF抑制劑維莫非尼治療后，BRAF V600E突變的兒童膠質母細胞瘤完全消退[57]。因此，通過DNA測序或使用BRAF V600E特異性抗體免疫組織化學進行BRAF突變的分子檢測，可能會在小部分膠質母細胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)潛在的新型靶向治療選擇。

2.8 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸無蛋白編碼功能的RNA分子。LncRNA通過轉錄或者轉錄后修飾調節(jié)基因的表達，從而實現(xiàn)生物學功能[58]。在腦膠質瘤中，LncRNA參與多種惡性生物學行為。通過作為miRNA海綿或調節(jié)表觀遺傳等生物學機制，影響腦膠質瘤的DNA損傷，細胞周期調控和信號轉導途徑[59]。

在膠質母細胞瘤中，LncRNA MALAT1已經被報道促進GBM的替莫唑胺耐藥，并且靶向MALAT1的納米化合物可使GBM對替莫唑胺化療敏感[60]。有研究表明，LINC01446的高表達作為靶向TPT1的miR-489-3p的分子海綿，促進GBM惡性生物學行為并伴隨較差的患者預后[61]。LncRNA HOTAIR受溴結構域蛋白BRD4調控，進而調節(jié)神經膠質瘤細胞的細胞周期[62]。近年來，隨著lncRNA研究日趨火熱，針對膠質母細胞瘤患者的個體化治療和診斷有指導意義的靶向lncRNA分子還在不斷地發(fā)現(xiàn)和探索中。

3 結語

目前，臨床治療中已有各種特異類型的分子標記物應用于臨床診斷和判斷患者預后水平，如IDH1/2基因突變檢測，MGMT甲基化檢測等特異性突變檢測和基因組學方法的實際應用。膠質母細胞瘤中基因和分子的畸變?yōu)榻⑦m當?shù)呐R床相關生物標志物提供了基礎，并有待開發(fā)新的治療方法。我們正處于從膠質母細胞瘤分子分類研究進展為更有效的靶向治療研究的階段。同時，遺傳學、表觀遺傳學和轉錄譜的多平臺分析證明這些分子標志物可用于改進腦腫瘤的分類并預測患者預后水平。希望這種精確診斷療法可以使得患者的預后水平逐步改善，將有效的治療方法與患者的分子亞型進行匹配。雖然隨著分子分型的研究日趨火熱，但我們仍然與膠質母細胞瘤患者的實質性改善和最終治愈有很大的距離。精準的分型和生物學理解雖然是個性化治療的一個關鍵特征，但它只是其中的一個組成部分，還需與藥物的研發(fā)和改善患者預后水平總體目標的模式相輔相成。