新疆黑種草子總黃酮體外抗宮頸癌活性研究

盛 磊，武貴臻，熱娜古麗·熱依木，艾尼娃爾·艾克木*

(1．新疆醫(yī)科大學新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學藥物分析教研室，新疆烏魯木齊 830011；3．新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院，新疆烏魯木齊 830011)

黑種草子為毛茛科植物腺毛黑種草(Nigella glandulifera Freyn et Sint.)的干燥成熟種子，在中國新疆有悠久的栽培歷史，是當地少數民族常用的藥材，被應用于婦科疾病且有較好的療效[1]。黑種草子除了富含脂肪酸和揮發(fā)油外，還含有黃酮類、皂苷類及生物堿類等多種化合物[2]。其中黃酮類化合物由于其藥用價值廣泛、生物活性強、毒副作用小的特點，在醫(yī)藥領域有著廣闊的應用前景和潛在的開發(fā)利用價值，一直為國內外的研究熱點[3]。以往研究發(fā)現，黃酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性[4-9]，但到目前為止黑種草子總黃酮在抗腫瘤方面的研究甚少。基于黑種草子為新疆民族醫(yī)婦科常用藥的特點，本研究以宮頸癌細胞株(SiHa和HeLa)為對象，采取MTT法檢測新疆黑種草子總黃酮成分對宮頸癌細胞株的體外抗增殖活性，劃痕實驗檢測新疆黑種草子總黃酮成分對宮頸癌細胞株遷移的影響，使用流式細胞儀檢測藥物干預前后宮頸癌細胞株的凋亡情況，初步探討新疆黑種草子總黃酮成分的體外抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

宮頸癌細胞株(SiHa和HeLa)購自中國科學院上海生物化學研究所細胞庫。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，購于HyClone公司；胎牛血清，購于Gibco公司；青霉素/鏈霉素溶液，購于HyClone公司；MTT購于Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒，購于BD公司；新疆黑種草子購于新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院。

1.3 儀器設備

細胞圖像觀察及采集使用Leica DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡(Leica公司)；MTT結果檢測使用Thermo Multiskan GO全波長酶標儀(Thermo公司)；細胞凋亡率檢測使用LSRⅡ流式細胞檢測儀(BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分數為5%的條件下分別培養(yǎng)宮頸癌SiHa和HeLa細胞株，每隔2～3 d需更換完全培養(yǎng)基1次，待細胞鋪滿80%～90%瓶底面積時，使用0.25%的胰蛋白酶消化后按1∶3或1∶4的比例進行傳代。

1.4.2 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細胞增殖檢測 取對數生長期宮頸癌細胞，以2×105個/mL的濃度接種于96孔板，每孔200μL。待細胞貼壁后，分別以2.5、5、10、15、20、25和50μg/mL的黑種草子總黃酮進行體外處理，空白對照組加入等體積的生理鹽水。處理24 h后，使用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)，加入MTT工作液，37℃孵育4 h后490 nm處檢測吸光度D(490)值。按照公式：抑制率=[D(490)對照組-D(490)處理組]/D(490)對照組×100%，計算各濃度下的增殖抑制率，以受試物濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標繪制黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線，使用SPSS軟件以probit模型計算出黑種草子總黃酮體外抗腫瘤的IC50。

1.4.3 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細胞遷移檢測 取對數生長期宮頸癌細胞，以2×105個/mL的濃度接種于6孔板，每孔2 mL。待細胞貼壁后，使用10μL槍頭在每孔中做一條垂直于板底的劃痕，PBS沖洗去除劃下的細胞。處理組每孔加入2 mL含藥培養(yǎng)基(15μg/mL)，空白對照組每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基，每組3個復孔。分別于處理的0和24 h拍攝并測量劃痕寬度，計算每組處理前后劃痕寬度的差值(d)。

1.4.4 黑種草子總黃酮體外誘導腫瘤細胞凋亡檢測

取對數生長期宮頸癌細胞，以2×105個/mL的濃度接種于6孔板，每孔2 mL。待細胞貼壁后，分別以不同濃度(10、15和25μg/mL)的黑種草子總黃酮進行處理，空白對照組加入等體積的生理鹽水。處理24 h后分別收集各組細胞，細胞凋亡檢測試劑盒染色后采用流式細胞儀進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行MTT檢測數據的統(tǒng)計分析，吸光度值結果以xˉ±s表示，兩樣本均數比較采取t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 黑種草子總黃酮的體外抗腫瘤細胞增殖活性

使用MTT法分別檢測黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株SiHa和HeLa的增殖抑制作用，結果發(fā)現黑種草子總黃酮均是在濃度為10μg/mL時對SiHa和HeLa細胞株開始發(fā)揮增殖抑制作用(P＜0.05)，之后隨著濃度的升高黑種草子總黃酮對兩種宮頸癌細胞株的抑制率也不斷升高，顯現良好的量效依賴關系(表1、表2)。以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線(圖1)，發(fā)現黑種草子總黃酮對兩種宮頸癌細胞株具有相似作用效果，均在濃度為10μg/mL時發(fā)揮增殖抑制作用，而在20～25μg/mL時進入平臺期。分別對兩組MTT結果的濃度和抑制率進行Probit回歸分析后得到效應概率為50%時的受試物濃度(IC50)，黑種草子總黃酮對SiHa細胞株的IC50為16.935 μg/mL，對HeLa細胞株的IC50為18.366 μg/mL。

表1 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株SiHa的體外抑制作用()

表1 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株SiHa的體外抑制作用()

*獨立樣本t檢驗，所列數據均為與空白對照組比較的結果.

組別空白對照組黑種草子總黃酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.561±0.035 0.550±0.027 0.529±0.028 0.506±0.019*0.339±0.072*0.089±0.005*0.089±0.003*0.087±0.002*t 0.500 1.436 2.761 5.527 26.791 26.962 27.179 P*-0.635 0.201 0.043 0.001＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-1.96 5.70 9.80 39.57 84.14 84.14 84.49

表2 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株HeLa的體外抑制作用()

表2 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株HeLa的體外抑制作用()

*獨立樣本t檢驗，所列數據均為與空白對照組比較的結果.

組別空白對照組黑種草子總黃酮 2.5μg/mL 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 20μg/mL 25μg/mL 50μg/mL D(490)0.929±0.019 0.928±0.017 0.894±0.057 0.843±0.041*0.649±0.023*0.240±0.030*0.085±0.003*0.092±0.003*t-0.079 1.184 3.817 18.605 38.903 87.538 87.099 P*-0.940 0.281 0.009＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01抑制率/%-0.11 3.77 9.26 30.14 74.17 90.85 90.10

圖1 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤活性曲線

2.2 黑種草子總黃酮處理后腫瘤細胞形態(tài)學觀察

對處理后的宮頸癌細胞進行形態(tài)學觀察發(fā)現：對照組SiHa和HeLa細胞均為單層貼壁生長，細胞個體飽滿，透明度大，折光性強，細胞密度達90%以上，SiHa細胞形態(tài)為梭形而HeLa細胞為多角形；在處理組中，兩種宮頸癌細胞形態(tài)均隨著藥物濃度的增加而逐漸回縮，細胞輪廓清晰，折光性下降，細胞密度逐步降低，死細胞數目增多(圖2、圖3)。

圖2 黑種草子總黃酮處理后SiHa細胞形態(tài)學觀察(×100)

2.3 黑種草子總黃酮體外抗腫瘤細胞遷移檢測

圖3 黑種草子總黃酮處理后HeLa細胞形態(tài)學觀察(×100)

通過劃痕實驗檢測黑種草子總黃酮體外對宮頸癌細胞株SiHa和HeLa遷移的影響，結果顯示：體外處理24 h后，SiHa和HeLa細胞株空白對照組劃痕處細胞均趨于匯合，而處理組劃痕處變化不大(圖4、圖5)。使用處理前后劃痕處的寬度差表示細胞的相對遷移距離，結果如表3所示，SiHa細胞株空白對照組的腫瘤細胞相對遷移距離為(223.333±13.868)px，處理組的相對遷移距離為(56.333±10.970)px；HeLa細胞株空白對照組的腫瘤細胞相對遷移距離為(360.667±15.308)px，處理組的相對遷移距離為(13.000±3.606)px，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表3 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株的體外誘導凋亡作用()

表3 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株的體外誘導凋亡作用()

*獨立樣本t檢驗，所列數據均為與空白對照組比較的結果.

腫瘤細胞株SiHa HeLa分組空白對照組處理組空白對照組處理組相對遷移距離/px 223.333±13.868 56.333±10.970*360.667±15.308 13.000±3.606*t 16.358 38.290 P＜0.01＜0.01

圖4 SiHa細胞劃痕實驗(×50)

圖5 HeLa細胞劃痕實驗(×50)

2.4 黑種草子總黃酮體外誘導腫瘤細胞凋亡檢測

使用Annexin V和PI分別對空白對照組和處理組細胞進行染色，采用流式細胞儀進行細胞凋亡項目檢測，結果顯示黑種草子總黃酮對SiHa和HeLa細胞均具有誘導凋亡的作用(表4)，并且這種作用隨藥物濃度的增加而增強，顯示出良好的量效依賴關系(圖6、圖7)。在SiHa細胞中，相對于空白對照組(4.0±0.2)%的凋亡率，低濃度組(10μg/mL)的凋亡率為(8.5±0.5)%，中濃度組(15μg/mL)的凋亡率為(35.9±1.3)%，高濃度組(25μg/mL)的凋亡率為(85.7±1.6)%；在HeLa細胞中，相對于空白對照組(0.4±0.1)%的凋亡率，10μg/mL組的凋亡率為(5.3±0.4)%，15μg/mL組的凋亡率為(11.4±0.8)%，25μg/mL組的凋亡率為(85.9±1.9)%，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

表4 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株遷移的影響()

表4 黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞株遷移的影響()

*獨立樣本t檢驗，所列數據均為與空白對照組比較的結果.

組別空白對照組10μg/mL 15μg/mL 25μg/mL SiHa細胞凋亡率4.0±0.2 8.5±0.5*35.9±1.3*85.7±1.6*t--14.047-41.418-89.319 P-＜0.01＜0.01＜0.01 HeLa細胞凋亡率0.4±0.1 5.3±0.4*11.4±0.8*85.9±1.9*t--20.192-24.870-77.448 P-＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤[10-11]，據2017中國腫瘤登記中心年報顯示，我國宮頸癌發(fā)病率高(9.6/10萬)，每年約有15萬新發(fā)病例，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數的28%，每年約有8萬名婦女死于宮頸癌[12]。新疆是我國宮頸癌的高發(fā)區(qū)，其中維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)病率是相同地區(qū)漢族婦女宮頸癌發(fā)病率的3～4倍[13-14]，死亡率居全國少數名族宮頸癌死亡率首位[15]。因此，宮頸癌的防治是新疆地區(qū)醫(yī)療面臨的重要問題。

宮頸癌的治療采用以手術治療為主，并輔以放射及化學藥物綜合治療。順鉑(DDP)作為宮頸癌常用的化療藥物之一[16]，具有抗癌譜廣、療效確切等特點[17-18]，同時也具有骨髓抑制，腎臟毒性，神經毒性，胃腸道反應，過敏反應，電解質紊亂等一系列毒副作用[19-20]，導致患者生存質量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中止治療。尋找一種有效的天然抗癌新藥，使其與傳統(tǒng)化療藥聯合使用，降低傳統(tǒng)化療藥物的使用劑量，進而減輕化療的毒副作用，提高患者耐受程度及生存質量，對宮頸癌的治療具有積極意義。

腫瘤細胞具有兩大生物學特性：永生性和遷移性。永生性是腫瘤細胞無限增殖的根本原因，遷移性則是腫瘤發(fā)生浸潤轉移的物質基礎。因此，抗腫瘤細胞增殖是抗腫瘤藥物的重要特性，如何控制腫瘤細胞的遷移則是腫瘤治療的另一關鍵問題。本研究使用黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞SiHa和HeLa進行體外處理，MTT法檢測黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞的體外抗增殖作用，結果顯示黑種草子總黃酮在體外對SiHa和HeLa細胞均具有較好的抗增殖活性，且對兩種細胞株有相似的最大抑制率及IC50。細胞形態(tài)學觀察進一步支持了MTT檢測結果，隨著藥物濃度的不斷增大，腫瘤細胞失去了應有的形態(tài)，細胞活力降低，活細胞數目不斷減少。劃痕實驗檢測黑種草子總黃酮對宮頸癌細胞的體外抗遷移作用，結果顯示黑種草子總黃酮在體外對SiHa和HeLa細胞均具有明顯的抗遷移作用。

圖6 黑種草子總黃酮對SiHa細胞的體外誘導腫瘤細胞凋亡檢測

圖7 黑種草子總黃酮對HeLa細胞的體外誘導腫瘤細胞凋亡檢測

凋亡是細胞的程序性死亡，在機體的生長發(fā)育、免疫耐受等方面發(fā)揮著非常重要的作用，同時在整個生命周期中維持著機體的穩(wěn)態(tài)。細胞有增殖、分化和凋亡的特征，三者相互協調，共同調節(jié)。有研究顯示細胞凋亡作用的失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關[21]。自1992年Hickman[22]等首次提出誘導腫瘤細胞凋亡可作為腫瘤治療研究中的主要目標和手段以來，治療性細胞凋亡干預作為一種發(fā)展中的疾病治療手段，已逐漸成為國內外腫瘤治療研究的一個熱點。本研究細胞凋亡檢測結果顯示，黑種草子總黃酮在體外可誘導SiHa和HeLa細胞凋亡的發(fā)生，且呈現良好的量效依賴關系。綜合上述結果分析發(fā)現，黑種草子總黃酮具有體外抗宮頸癌細胞株增殖及遷移作用，同時能夠誘導宮頸癌細胞株發(fā)生凋亡。

綜上所述，新疆黑種草子總黃酮可能在治療宮頸癌方面具有潛在的藥用價值，本研究為進一步探索和開發(fā)新疆地區(qū)道地藥材奠定了基礎。