3種市售蚊香液對植物根尖細胞的遺傳損傷效應

李 瑩，陳霞明，李函融，羅 特

(廈門大學嘉庚學院，河口生態安全與環境健康福建省高校重點實驗室，福建 漳州 363105)

蚊香作為夏季驅蚊的主要產品，主要包括盤式蚊香、電熱蚊香片和電熱蚊香液3種劑型[1]，其中，電熱蚊香液由于其日揮發量小、有效成分穩定等優點廣受消費者的歡迎[2]。蚊香液包括殺蟲有效成分、溶劑、穩定劑、恢散調整劑及香料等成分，其有效成分多以擬除蟲菊酯類為主[3]。然而，隨著擬除蟲菊酯類物質的廣泛應用，隨之帶來的農藥殘留超標和環境污染問題日益嚴重[4]。1998年，美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency，USEPA)已將氰戊菊酯、氯氰菊酯和氯菊酯等擬除蟲菊酯類物質列入67種環境內分泌干擾物黑名單[5]。研究指出，擬除蟲菊酯是一種重要的神經毒劑，其作用機制與滴滴涕(dichloro diphenyl trichloroethane，DDT)類似，主要通過干擾神經轉導而產生毒性作用使害蟲致死[6]。同時，擬除蟲菊酯作為一類親脂性殺蟲劑，在水體中可直接進入水生動物的血液，并可在其體內富集，引起中毒反應[7]。研究發現氟氯氰菊酯污染物會影響草魚肝腎的生理功能[8]；聯苯菊酯和醚菊酯暴露下，對真鯛的安全濃度分別為0.12μg/L和0.02 mg/L，分別屬于劇毒和高毒物質[9]；氰戊菊酯、溴氰菊酯對凡納對蝦的安全濃度分別為0.014和0.011μg/L，均屬于極高毒藥物[10]；溴氰菊酯暴露會導致淡水中華絨螯蟹肝胰腺MDA含量增加，機體非特異性防御系統受到損傷，肝胰腺正常細胞結構受到破壞，屬于高毒物 質[11]。研究還發現，擬除蟲菊酯在哺乳動物體內可以被相應的酶類分解代謝，但其對哺乳動物依然具有低毒性，存在致癌、致畸、致突變的潛在威脅[12]。馬拉硫磷、毒死蜱、氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯單獨與聯合經口染毒均可致小鼠骨髓細胞微核率、精子畸形率增加，且聯合染毒對小鼠的遺傳損傷具有一定的相加作用，具有引起遺傳毒性的風險[13]；氟丙菊酯原藥對雄性大鼠經口染毒劑量為3.91 mg/(kg·d)及以上，對雌性大鼠經口染毒劑量為3.62 mg/(kg·d)及以上時，可產生毒性效應[14]。對植物的研究發現馬拉硫磷、毒死蜱、氰戊菊酯劑量濃度達到10μg/mL時，會對蠶豆根尖細胞造成遺傳損傷[15]；13.65 mg/L的辛硫磷、25 mg/L的四聚乙醛對大蒜根尖細胞有較強的染色體致畸變作用[16]。目前，擬除蟲菊酯類物質的使用量不斷增加，其可通過降雨徑流、大氣干濕沉降等途徑進入土壤和水體，從而在水體及其底泥、農林業用地的水及土壤中大量殘留[17]。為更全面地評估蚊香液的生物學作用，開展蚊香液對植物的遺傳毒性研究具有重要意義。

微核是常用的遺傳毒理學指標之一，常被用來評價環境誘變因子對生物遺傳物質的損傷程度[18]，具有靈敏、簡便、快速的特點，并與動物試驗結果高度一致；植物根尖微核檢測技術已廣泛運用于檢測環境污染物、常用農藥等的致突變作用[19-20]。該研究以3種植物蠶豆、大蒜和洋蔥作為實驗材料，分析不同濃度的蚊香液對植物根尖細胞微核率及微核指數的影響，探討蚊香液對不同植物遺傳損傷程度的差異，同時比較不同品牌蚊香液對植物細胞微核率的差異，以期為蚊香液的安全使用提供參考依據和數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

蠶豆種子，產自山東菏澤。普通大蒜、洋蔥、3種品牌蚊香液(BBN、JJ、YB，以品牌名稱首字母表示)，均購自福建省漳州市開發區南濱大道豐順超市；其中，BBN和JJ品牌蚊香液均標明其有效成分為0.8%的氯氟醚菊酯，YB蚊香液標明其“在農藥登記證上列為微毒，是農藥毒性評級的低級”，而未體現其具體有效成分。

1.2 實驗方法

1.2.1 蚊香處理液的制備 根據預實驗結果，制備不同濃度梯度的蚊香處理液，將3種品牌蚊香液均用蒸餾水分別稀釋4倍、2倍、1.33倍，振蕩搖勻，制備成體積濃度為25%、50%和75%的蚊香處理液，蒸餾水作為空白對照組。

1.2.2 微核試驗 選取飽滿、均勻的蠶豆種子，同時選取長勢良好的大蒜和洋蔥，分別洗凈后置于裝有蒸餾水的燒杯和培養皿中，置于室溫(若室內溫度低于25℃，需放入25℃的恒溫箱中)，浸泡24 h，此期間至少換水2次。隨后轉入裝有少量蒸餾水的培養皿中，繼續催芽，保持濕度，浸泡24～48 h，期間換水4～6次，待種子生出根長至2～3 cm，選取初生根尖生長良好、根長一致的蠶豆種子、大蒜蒜瓣和洋蔥(每顆大蒜蒜瓣和每個洋蔥均有多個根尖)，各分為10組(蠶豆每組5～7粒，大蒜蒜瓣每組2～3顆，洋蔥每組1個)，分別置于裝有不同蚊香處理液的30個發芽盒中，其中，每種植物需用3種蚊香液處理，每種蚊香液各設3個處理濃度，共計9個蚊香液處理組，再設1個空白對照組。室溫下培養24 h，供試液需沒過完整根尖。將處理后的種子，用蒸餾水浸洗3～4次，從根尖頂端切下1 cm長的幼根放入抗生素空瓶中，加卡諾氏固定液(無水乙醇與冰醋酸按照體積比例3∶1配制)固定24 h，固定后的幼根如來不及制片時，可放入70%的乙醇中，置4℃冰箱內待下次制片。

1.2.3 染色制片 取固定好的根尖，蒸餾水沖洗3 min，加入6 mol/L的鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解10 min，待幼根軟化即可。將解離后的幼根水洗3 min并吸干，挑取1個根尖的乳白色分生組織(大約1 mm左右，不宜過大)置于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴改良苯酚品紅染液，染色10～15 min。在經染色的根尖上再加1滴染液，蓋上蓋玻片，覆1層吸水紙，將多余的改良苯酚品紅溶液吸去，用帶橡皮頭的鉛筆垂直地輕輕敲打蓋玻片，使根尖充分分散壓平，便于觀察微核。

1.2.4 鏡檢及微核識別標準 在低倍鏡下選擇細胞分散均勻、無損傷、染色良好的根尖分生區進行觀察，再轉高倍鏡觀察記錄細胞的微核數量。微核的識別嚴格按照國家環保局植物根尖微核試驗的規范方法[21]，在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核，小核著色與主核相當或稍淺，小核形態為圓形、橢圓形或不規則形。每個實驗組觀察6張玻片，選取其中4張計算平均微核率(micronucleus，MCN，‰)和微核指數(即污染指數，pollution index，PI)，每個根尖計數500個細胞中的微核數。

1.3 數據處理

MCN/‰=樣品檢出微核的細胞數/樣品檢測的細胞總數×1 000‰

所測樣品的MCN與對照比較，PI值≥1.5判斷樣品對植物造成遺傳損傷[21]。

實驗結果用Excel 2013計算樣品的平均值±標準差，用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析，采用LSD法進行差異性檢驗，采用Duncan法進行組間多重比較，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 3種蚊香液處理植物根尖后細胞的微核觀察

鏡檢發現，3種蚊香處理液均可誘導植物根尖細胞產生微核，且均為單微核，這些微核結構出現的頻率與不同蚊香處理液濃度有一定的關系(圖1)。

圖1 蚊香液處理植物根尖細胞后的微核觀察

2.2 不同濃度的蚊香液對植物根尖細胞微核率的影響

如表1所示，BBN、JJ、YB 3種蚊香液的各濃度處理組與對照組相比，微核率均出現不同程度的增加，但僅75%濃度組的增量差異具有統計學意義(P＜0.05)。各濃度處理組微核指數均≥1.5，表明對蠶豆根尖細胞造成了一定的遺傳損傷。同種蚊香液不同濃度之間比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

如表2所示，3種蚊香液處理組與對照組相比，微核率有不同程度上升，但僅有JJ和YB蚊香液的75%濃度組與對照組差異具有統計學意義(P＜0.05)。蚊香液各濃度組的微核指數均≥1.5，表明對大蒜根尖細胞均造成遺傳損傷。同種蚊香液不同濃度間比較，發現BBN和JJ蚊香液各濃度組處理的大蒜根尖，差異無統計學意義(P＞0.05)；YB蚊香液的25%和75%濃度組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 不同濃度的蚊香液對蠶豆根尖細胞微核率的影響(n=500)

表2 不同濃度的蚊香液對大蒜根尖細胞微核率的影響(n=500)

如表3所示，3種蚊香液處理組與對照組相比，微核率有不同程度的增加，與對照組相比，JJ和YB蚊香液的25%濃度組觀察到的微核數較少，差異無統計學意義(P＞0.05)，其他濃度組差異具有統計學意義(P＜0.05)。隨蚊香液濃度增加，細胞微核數隨之增加，微核指數均≥1.5，即3種蚊香液對洋蔥根尖細胞均具有致突變性。同種蚊香液不同濃度之間比較，均存在明顯差異(P＜0.05)。

表3 不同濃度的蚊香液對洋蔥根尖細胞微核率的影響(n=500)

2.3 3種植物根尖細胞微核率的對比

如圖2所示，BBN、JJ和YB蚊香液處理3種植物根尖，隨蚊香液濃度增加，蠶豆、大蒜和洋蔥的根尖細胞微核率均呈現增加趨勢，3種植物對照組微核率間差異無統計學意義(P＞0.05)，即排除試驗方法等因素對3種植物細胞微核率的差異。JJ和YB蚊香液75%濃度組處理的洋蔥根尖細胞微核率高于對應濃度的蠶豆根尖細胞微核率，差異顯著(P＜0.05)。

圖2 蚊香液對不同植物根尖細胞微核率對比

2.4 3種品牌蚊香液誘導植物根尖細胞損傷程度的對比

如圖3所示，3種品牌蚊香液作用于蠶豆、大蒜和洋蔥，產生了不同程度的遺傳損傷，微核率隨濃度變化具有一致的規律性。微核率在同一濃度3種蚊香液之間比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，總體表現為3種品牌蚊香液對實驗植物根尖細胞產生的毒性效應差異較小。

圖3 3種品牌蚊香液對植物根尖細胞微核率影響的對比分析

3 討論

本研究發現，當蚊香處理液作用于蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細胞時，均可誘導植物根尖細胞產生微核現象，其微核率均高于對照組，且隨濃度的增加，蚊香液處理液誘導3種植物根尖細胞微核率也隨之增加，可能是由于高濃度蚊香液暴露使得細胞有絲分裂會受影響，紡錘體功能得不到正常發揮，從而影響DNA的復制，也可能在這種較高的濃度下，細胞的呼吸作用會受到抑制，影響了細胞生長。楊玉英研究了溴氰菊酯對紫露草根尖細胞的誘變作用，實驗顯示在一定濃度范圍內，溴氰菊酯水溶液浸泡可以使紫露草微核率升高，存在一定的劑量-反應關系[22]。卜寧等在農藥氰戊菊酯和三氟氯氰菊酯對蠶豆的致突變研究中發現，在一定濃度范圍內，蠶豆根尖細胞微核率會隨暴露濃度的升高而增加，同時，這兩類擬除蟲菊酯還可誘導蠶豆根尖細胞產生較高頻率、多種類型的染色體畸變，對蠶豆根尖細胞具有明顯的遺傳毒性[23]。以上研究均表明高濃度的污染物質可以增加植物根尖細胞微核的產生，對植物的遺傳物質產生不同程度的損傷。

本文研究還發現，蚊香液處理可以誘導蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細胞微核的產生，說明蚊香液對植物可以產生一定的遺傳損傷。本研究中，同種實驗條件下，高濃度(75%)的JJ和YB蚊香液誘導洋蔥根尖細胞微核率明顯高于蠶豆(P＜0.05)，而大蒜與二者均無顯著差異(P＞0.05)，且低(25%)、中(50%)濃度組的3種蚊香處理液誘導3種植物根尖細胞微核率無統計學差異(P＞0.05)，表現為高濃度蚊香液暴露條件下，洋蔥較蠶豆更敏感，中、低濃度暴露對3種植物敏感性差異不大。有研究指出蠶豆根尖細胞周期中的大部分時間對誘變劑敏感，便于遺傳毒性的檢測[24]；而與蠶豆相比，大蒜和洋蔥作為可用鱗莖進行營養繁殖的植物，其取材方便、遺傳性能穩定，每瓣/個鱗莖可以發出數條不定根，用一瓣/個鱗莖作為一個處理可以消除不同個體處理間的個體差異，也常被作為微核試驗材料[25-27]。本研究中，由于蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細胞對蚊香液均具有較高的靈敏性，并在實驗濃度范圍內具有劑量效應，因此，3種植物根尖細胞微核率在一定程度上可以反映蚊香液的污染程度，可用于蚊香液的污染檢測。

本研究以3種市面常用品牌的蚊香處理液對植物根尖進行誘導，其微核率相差不大，未形成明顯統計學差異。有研究指出，氯氟醚菊酯對淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)幼蟲和家蠅(Musca domestica)幼蟲的LC50分別為0.94μg/L和4.2μg/g，其防治效果優于四氟甲醚菊酯、四氟苯菊酯和右旋炔丙菊酯這三類擬除蟲菊酯農藥[28]。也有研究發現阿拉伯按蚊(Anopheles arabiensis)和白紋伊蚊(Aedes albopictus)在含0.08%氯氟醚菊酯的盤蚊香暴露1 h后，二者24 h的死亡率均超過90%[29]，而致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)的死亡率可達100%[30]。以上研究均表明氯氟醚菊酯類物質對昆蟲表現出較高的毒殺活性。此外，將幼鼠暴露于0.08%氯氟醚菊酯電熱蚊香片后，其肝臟谷丙轉氨酶(ALT)含量、肝臟器系數、肝臟濕重均顯著升高，且肝細胞胞質疏松、部分肝細胞腫脹、嗜堿性小體減少、肝索排列紊亂，表現為組織學異常，呈現出一定的肝臟毒性[31]。結合本研究，擬除蟲菊酯類物質可以對動植物產生一定的生物毒性，而市售不同品牌的蚊香產品之間毒性差異尚不明顯。