HHV-6A感染對神經膠質瘤細胞Ln cRNA M EG 3表達及增殖凋亡侵襲轉化的影響

萬 昕，胡 月，章 菊，陳 云，金佩佩，*

(1．中國科學技術大學附屬第一醫院/安徽省立醫院檢驗科，安徽 合肥 230036；2．中國科學技術大學附屬第一醫院/安徽省立醫院婦產科產前診斷中心，安徽 合肥 230036；3．南京醫科大學微生物與免疫學系，江蘇 南京 211100)

神經膠質瘤是大腦中最常見的原發性腫瘤，約占所有腦惡性腫瘤的50%～60%[1]。傳統治療惡性腦膠質瘤的首選方法是手術切除，再輔以化療、放療或綜合放化療，但是膠質瘤的發病機制復雜，加之其侵襲性生長等特性都使得臨床治療策略受到很大限制[2-4]。因此，進一步了解膠質瘤相關發病機制顯得尤為重要。

最新研究提示病毒也可能是神經膠質瘤的重要誘發因素。人類皰疹病毒6型(human herpesvirus 6，HHV-6)是一類嗜人淋巴細胞雙鏈DNA病毒，可分為A和B兩個亞型[5]。其中HHV-6A亞型被認為與多種神經系統疾病包括神經膠質瘤存在相關性[6]。在膠質瘤組織中可檢測到高百分比的HHV-6A核酸及蛋白質成分，同時HHV-6A感染也可上調星形膠質細胞分泌促炎細胞因子[7]。眾多研究顯示HHV-6A可能是一種影響膠質瘤發生發展的重要潛在病原體，但是其具體的致病或調控機制還有待進一步探索和驗證。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近年研究發現的一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，它通過多種途徑調控腫瘤基因或者控制細胞增殖和循環[8-9]。目前已有若干LncRNAs被認為在惡性腦膠質瘤發生發展過程中起到重要的調節作用[10-11]，但具體作用機制仍不清楚。高通量RNA測序結果顯示LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET在膠質瘤及其癌旁組織中的表達有顯著差異，且表達峰及穩定性均較好，同時已有研究認為在膠質瘤及其他若干腫瘤中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET與癌癥的發生發展都具有密切的相關性[12-15]。為了進一步觀察LncRNAs對膠質瘤的調控作用以及明確其表達是否和HHV-6A感染存在相關性，本研究選取與膠質瘤發病相關性較強的LncRNA MEG3，同時驗證其表達與HHV-6A感染的相關性，并對病毒感染后神經膠質瘤細胞增殖、凋亡及上皮間充質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)等情況進行觀察，以揭示HHV-6A對膠質瘤發生發展的可能調控方式。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人星形膠質細胞株HA-1800購自美國ATCC公司，U251、U87及U373等人神經膠質瘤細胞購自中科院上海細胞庫，HHV-6A GS標準株及人急性淋巴母細胞白血病細胞(HSB-2)由南京醫科大學微生物與免疫實驗室保存提供。DMEM/F12培養基和DMEM培養基購自美國Hyclone公司，RPMI1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，實時定量PCR試劑盒購自瑞士Roche公司，CCK-8試劑盒及RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司，Snail、E-cadherin、Vimentin及GAPDH等單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司，抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司，ECL顯影液購自美國Thermo公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，流式細胞儀購自美國BD公司，倒置光學顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.2 臨床標本收集

實驗涉及的37例膠質瘤組織、4例癌旁組織以及18例正常腦組織等人體標本均收集于南京醫科大學第一附屬醫院神經外科手術后(2017年1月—2018年1月)，患者年齡25～70歲。進一步統計膠質瘤患者各臨床指標(性別、年齡、腫瘤大小及分級等)，并分析這些指標與膠質瘤組織中LncRNA MEG3的表達高低是否有關系。所有樣品的采集均獲得腫瘤患者和志愿者的同意，且研究涉及的實驗獲南京醫科大學研究倫理委員會和江蘇省機構審查委員會的批準。

1.3 實時定量PCR

在GenBank中搜索目的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件輔助設計并結合文獻報道，最終篩選確定PCR引物序列：LncRNA MEG3，上游GAGTG TTTCCCTCCCCAAGG；下游GCGTGCCTTTGGTGATT CAG。LncRNA H19，上游TCAAGCCTGGGCCTTTG AAT； 下 游 CTGCTGTTCCGATGGTGTCT。 LncRNA LET，上游GTGACTCCCTCCAGATGTGC；下游ACTC TTGCCTTGGGAGTCCT。β-actin，上游 TGGCACCCA GCACAATGAA；下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。收集臨床膠質瘤組織及對應癌旁組織或正常腦組織標本，提取組織總RNA并反轉錄為cDNA，后續使用熒光實時定量PCR(qPCR)試劑盒配置20μL體系進行擴增，根據擴增曲線，由ABI 7500軟件系統嚴格分析獲CT得均值，以β-actin為內參校正濃度差異引起的誤差，最終以 2-ΔΔCT法計算分析出各個樣本目的LncRNAs的相對表達水平。

1.4 細胞培養和病毒感染

取對數生長期的HSB-2細胞，以一定濃度(1×105/mL)種于6孔細胞培養板中，加入含10%FBS的RPMI 1640培養基進行培養。24 h后，在每孔中接種100 μL HHV-6A GS病毒液，當HSB-2細胞病變效應大于80%時收集細胞懸液并測定病毒滴度(病毒滴度為各孔中CPE細胞平均數除以每孔中含有的病毒液體積)。根據所測定病毒滴度，用含2%FBS的RPMI 1640培養基配置病毒懸液，用于感染人神經膠質瘤或人星形膠質細胞(MOI=10)。后續選取HHV-6A病毒感染不同時間點(0、6、12、24及48 h)的正常神經膠質細胞株HA-1800以及感染24 h的神經膠質瘤細胞株U373，U251和SHG44細胞為實驗組，并以未經感染的細胞作為對照組。分別提取感染組及對照組細胞RNA并反轉錄為cDNA，同樣通過熒光實時定量PCR檢測分析感染前后各組細胞中LncRNA MEG3的表達變化。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況

選取LncRNA MEG3表達水平較高的膠質瘤細胞U373進行HHV-6A的感染培養，并以未感染的正常U373細胞作為對照。收集病毒感染前后細胞，調整細胞密度接種到96孔細胞培養板中(每孔1×103個)，加入胎牛血清，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養。分別于培養不同時間(24、48、72和96 h)取出培養板并在每孔細胞中加入10μL CCK-8溶液，再繼續孵育4 h后以測定吸光度D(450)值。以病毒感染組和對照組細胞的吸光度值為縱坐標，以培養時間為橫坐標繪制生長曲線，觀察細胞增殖情況。

1.6 細胞凋亡率檢測

收集HHV-6A感染24 h后及未感染的膠質瘤細胞U373，PBS漂洗3次后按試劑盒說明分別加入Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光孵育染色后采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.7 劃痕實驗

將U373細胞接種在6孔板中，添加完全培養基使其生長至匯合，通過HHV-6A感染U373細胞。24 h后棄除培養基，并使用移液槍頭尖端刮擦細胞面產生劃痕。小心移除刮脫的細胞并添加無血清培養基繼續培養，24 h后通過倒置光學顯微鏡觀察病毒感染和未感染的細胞，使用Image J軟件計算分析感染組和對照組細胞劃痕的愈合程度(劃痕面積及傷口愈合比)，以觀察病毒感染前后U373細胞遷移能力的變化。

1.8 Western blot法檢測

分別取HHV-6A感染24 h后的U373細胞以及未感染病毒的對照組細胞，使用RIPA裂解液分別裂解病毒感染前后的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，后將蛋白印跡轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，再分別加入一抗(兔抗人Snail、兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin或兔抗人GAPDH)，4℃孵育過夜。洗除一抗后，添加HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，繼續孵育1 h。最后使用ECL法進行顯影檢測，并通過灰度掃描分析蛋白相對表達水平。

1.9 統計學方法

使用GraphPad Prism 6.0軟件統計分析所得數據。膠質瘤組織與癌旁組織/正常腦組織的LncRNA表達水平，病毒感染與對照組細胞增殖凋亡及侵襲轉化等計量數據均以平均值±標準差形式表示，差異分析采用t檢驗。臨床計數資料通過例數表示，LncRNA MEG3表達高低分別與性別、年齡、腫瘤大小或腫瘤分級構成兩組變量的四格表數據，均分別采用Fisher's卡方檢驗，而在已確認的HHV-6A陽性膠質瘤患者中，LncRNA MEG3高低表達例數的差異應用t檢驗分析，P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤組織中相關LncRNAs的表達水平檢測

收集提取4例神經膠質瘤患者的腫瘤及對應癌旁組織RNA，通過qPCR分別測定其中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET的表達水平。結果顯示，相對癌旁組織，腫瘤組織中僅LncRNA MEG3的表達明顯降低(圖1A)，LncRNA H19和LncRNA LET的表達差異無統計學意義(圖1B和圖1C)。進一步收集33例膠質瘤患者腫瘤組織及18例正常腦組織，用qPCR檢測驗證其中LncRNA MEG3的表達水平。結果證實，LncRNA MEG3在膠質瘤組織中的表達水平顯著低于正常腦組織(P＜0.05，圖1D)。

臨床資料結果顯示LncRNA MEG3的表達高低與性別、年齡及腫瘤大小無關，而LncRNA MEG3低表達的膠質瘤患者構成比在分級越高的患者中大于分級低的患者(P＜0.05)。同時，在HHV-6A感染相關的膠質瘤中，LncRNA MEG3也更多地呈現出低表達趨勢(P＜0.05，表1)。

2.2 HHV-6A感染下調神經膠質細胞及膠質瘤細胞LncRNA MEG3的表達水平

圖1 實時熒光定量PCR檢測膠質瘤組織中相關LncRNAs的表達

表1 LncRNAMEG3表達與膠質瘤患者臨床指標(n=33)

實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，在HHV-6A感染HA-1800細胞6h后，該神經膠質細胞中LncRNAMEG3的表達即開始明顯減少(P＜0.01)，并隨著感染時間的延長而表達持續降低(圖2A)。此外，實時定量PCR結果同樣顯示，與未感染病毒的對照組細胞相比，在HHV-6A感染后24h，U373、U251和SHG44這3種膠質瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平較感染前顯著降低(P＜0.01)；而在未經HHV-6A病毒感染的情況下，3種膠質瘤細胞株中LncRNAMEG3的表達水平也明顯低于正常的膠質細胞株(圖2B)。

2.3 HHV-6A感染對神經膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響

圖2 實時熒光定量PCR檢測HHV-6A感染前后神經膠質及膠質瘤細胞LncRNAMEG3的表達

CCK-8法檢測感染前后不同時間點(24、48、72和96h)膠質瘤細胞U373的增殖情況，細胞生長曲線顯示，與未感染病毒的對照組細胞相比，在病毒感染48h時U373細胞的生長曲線有所升高，且差異具有統計學意義(P＜0.05，圖3A)。Annexin V/PI雙染色及流式分析結果顯示：HHV-6感染后U373細胞的凋亡率[(6.05±0.40)%]顯著低于未感染組細胞[(8.23±0.75)%]，差異具有統計學意義(P＜0.05，圖3B和3C)。

圖3 HHV-6A感染后U373細胞增殖及凋亡檢測

2.4 HHV-6A感染促進神經膠質瘤細胞的侵襲與EMT

通過細胞劃痕實驗觀察病毒感染(24 h)后膠質瘤細胞U373的遷移能力，結果見圖4。顯示未感染病毒的對照組細胞劃痕愈合度為(43.67±6.30)%，病毒感染后U373細胞劃痕愈合度為(72.33±6.90)%，提示病毒感染后U373細胞侵襲能力較未感染細胞增強(P＜0.05)。

圖4 劃痕實驗觀察HHV-6A感染后U373細胞的侵襲情況

在HHV-6A感染U373細胞24 h后，通過Western blot檢測感染前后U373細胞中Snail、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達水平并做統計分析。結果顯示，病毒感染后U373細胞中Snail及Vimentin蛋白的表達升高，而E-cadherin蛋白的表達降低(P＜0.05，圖5)，提示HHV-6A感染可能促進神經膠質瘤細胞的上皮-間質轉化。

3 討論

眾多研究認為HHV-6與多種神經系統疾病的發生發展相關，如多發性硬化、癲癇以及神經膠質瘤等[16]。與正常腦組織相比，在神經膠質瘤組織中可檢測到較高陽性率的HHV-6 DNA、早期蛋白以及晚期蛋白，同時在神經膠質瘤囊液中也能分離到HHV-6A病毒，這些研究結果均提示HHV-6和人神經膠質瘤有關[6，17]，但其具體作用機制仍然不是很清楚。

圖5 Western b lot檢測HHV-6A感染后U373細胞上皮間質轉化指標蛋白

LncRNA MEG3已被證實在多種腫瘤包括神經膠質瘤發展過程中起著重要的調控作用[12，18]。本研究發現：與癌旁或正常腦組織相比，LncRNA MEG3在膠質瘤組織中表達明顯降低，且膠質瘤細胞株中LncRNA MEG3的表達也較正常神經膠質細胞株低，借此推斷MEG3表達降低可能導致或促進膠質瘤的發生。值得注意的是，LncRNA MEG3低表達的膠質瘤組織顯示出更高的HHV-6A陽性率。體外感染細胞實驗顯示HHV-6A感染同樣可使膠質瘤細胞中LncRNA MEG3的表達持續下調，因此提示HHV-6A感染可能是引起LncRNA MEG3的表達下調，并進一步促進膠質瘤發生的重要原因之一。

LncRNA被認為可通過調控細胞增殖、凋亡、遷移和EMT等功能來影響癌癥的發生。EMT在腫瘤侵襲和轉移的過程中扮演著十分重要的角色，其主要的特征是上皮細胞連接蛋白如E-cadherin的喪失、間充質標記物如Vimentin的增加和細胞骨架重組等[19]。Snail蛋白家族是一類非常不穩定的轉錄因子，對翻譯后修飾很敏感，可通過羧基末端的鋅指結構域與E盒的DNA序列結合來抑制上皮細胞相關基因的表達，從而在EMT的發生和調控中扮演著重要的角色，MAPK的激活可直接上調Snail表達，并觸發PI3K等信號誘導EMT發生[20]。本研究在明確HHV-6A感染可以下調膠質瘤細胞LncRNA MEG3的基礎上，進一步發現HHV-6A感染可以促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力，并抑制其凋亡。同時，病毒的感染也加快了其EMT進程。ZHANG L等人[21]發現過表達LncRNA MEG3可以抑制神經膠質瘤細胞U251的增殖，并促進其凋亡。動物實驗也表明LncRNA MEG3的高表達可以抑制膠質瘤的發生及進展。此外，QIN等人[14]也證實了MEG3可作為miR-19a的競爭性內源性RNA來抑制膠質瘤細胞的增殖，遷移和侵襲。雖然下調LncRNA MEG3的表達可能只是HHV-6A促進膠質瘤發生的諸多調控機制之一，且其下游的具體信號通路仍需要深入探索，但這些結果為進一步研究HHV-6A在人神經膠質瘤以及其他相關中樞神經系統疾病中的作用機制研究提供了新的思路。