云南丹參主要有效成分含量的測定與比較

飛進強， 張圣潔， 徐紹忠， 趙昶靈

(云南農業大學 農學與生物技術學院， 云南 昆明 650201)

云南丹參(Salviayunnanensis)為多年生的草本植物，是唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)的代表植物[1]。該藥首載于《滇南本草》，其味苦, 性微寒，色赤象火，入心經。具有補心、生血、養心、定志、安神寧心、健忘怔忡、驚悸不寐、生新血、去瘀血、安生胎和落死胎等功效。一味可抵四物之功[2]，為云南習用的丹參藥材，廣泛分布于我國西南地區[3-4]。云南丹參的主要藥用部位為根部，其中的主要化學成分是脂溶性的二萜類和水溶性的酚酸類物質，藥效與2015版《中國藥典》中的丹參(Salviamiltiorrhiza)類似，都具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩及涼血消癰等作用[5]，主要用于改善缺血再灌注損傷、心腦血管疾病的治療[6-8]。云南丹參作為云南地方性藥材，功效與丹參相同，作為地方藥材收載入1974版的《云南省藥品標準》[9]。云南丹參在云南地區具有悠久的使用歷史，分布廣，資源豐富，具有較高的開發利用價值。目前我國對云南丹參的研究主要集中在化學成分和藥理活性方面，對種質資源的收集、栽培方式和化學含量之間的關系的研究尚處于空白。在用藥習慣上，將山東丹參稱為正品丹參，而云南丹參的利用未在藥用中進行使用，而對于云南丹參是否能成功代替山東丹參使用也存在爭議。錢子剛等[3]的研究發現，云南丹參的總丹參酮類含量比山東丹參略高，總酚酸含量約高1倍，丹參酮ⅡA含量略高；原兒茶醛含量約為山東丹參的3倍。靳鵬博[10]的研究表明，輕度遮陰處理有利于提高丹參中丹酚酸B的含量。為云南丹參的合理栽培、云南丹參替代山東丹參及云南丹參種質資源篩選、優良品種選育和道地藥材品質成因的研究提供理論依據，筆者采用高效液相色譜法對不同產地及不同栽培處理丹參的有效成分進行測定，并與山東丹參進行比較。

1材料與方法

1.1試驗材料

云南丹參：分別采集于云南個舊、蒙自、沾益和彌勒。山東丹參，采集于山東莒縣。采集不同地方的丹參均栽培于云南農業大學后山實驗基地，以山東丹參為對照，設置2種栽培處理：露地栽培和40%遮陰栽培。樣品信息見表1。

表1 丹參樣品采集信息

試劑與儀器：甲醇(色譜純，由Dima公司生產)，乙腈(色譜純，由美國fisher公司生產)，超純水、Cary 60 UV-Vis 紫外可見分光光度計(安捷倫科技中國分公司)，Aglient1260高效液相色譜儀(安捷倫科技中國分公司)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，ZA100R3 電子精密天平(上海贊維衡器有限公司)。對照品：丹參酮Ⅰ(批號：568-73-0)，隱丹參酮(批號：35825-57-1)，丹參酮ⅡA(批號：568-72-9),丹酚酸B(批號：115939-25-8)，由成都克洛瑪生物科技有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1供試品溶液的制備把不同種源的樣本丹參干燥至恒重，粉碎為細粉，過40目篩。稱取0.3 g細粉放置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇，密塞，精密稱定，30℃超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得丹參酮類供試品溶液。稱取0.15 g細粉放置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL的80%甲醇，密塞，精密稱定，30℃超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，移至10 mL量瓶中，加80%甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得丹酚酸B供試品溶液。

1.2.2標準品溶液的制備精密稱取標準品丹參酮Ⅰ、隱丹參酮及丹參酮ⅡA標準品，在加入甲醇制備為54 μg/mL、78 μg/mL及230 μg/mL的儲備液，濾過，即得丹參酮類物質的標準品。精密稱取丹酚酸B標準品適量，加入80%甲醇稀釋定容，制備為245 μg/mL的儲備液，濾過，即得丹酚酸B的標準品。

1.2.3色譜條件丹參酮類物質色譜條件：檢測波長270 nm，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)，流速為1.2 mL/min，柱溫25℃。以乙腈為流動相A，以0.02%磷酸為流動相B,梯度洗脫25 min，梯度洗脫0～6 min，A相61%，B相39%；6～20 min，A相61%～90%，B相39%～10%；20～20.5 min，A相90%～61%，B相10%～39%；20.5～25 min，A相61%，B相39%。進樣量10 μL。理論板數按丹參酮ⅡA不低于6 000。

丹酚酸B色譜條件：檢測波長286 nm，色譜柱為Agilent Exted-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃。以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸為流動相B，洗脫50 min，梯度洗脫0～15 min，A相17%～23%，B相83%～77%；15～30 min，A相23%～25%，B相77%～75%；30 min～40 min，A相25%～90%，B相75%～10%；40 min～50 min，A相90%，B相10%。進樣量10 μL。理論板數按丹酚酸B峰計算不低于6 000。

1.2.4高效液相色譜法考察線性考察:精密吸取各標準品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL進樣，按確定的色譜條件進行分析，以標準品溶液的進樣量為橫坐標(x)，相對峰面積為縱坐標(y)構建線性回歸方程。精密度試驗：精密吸取同一樣品的溶液，連續進樣6次，對各成分進行測定。重復性試驗：精密取同一丹參樣品，重復6次，制備樣品溶液，對各成分進行測定。穩定性試驗：精密吸取同一樣品溶液10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h后進樣，對各成分進行測定。加樣回收率試驗：精密稱量6份已知含量的樣品粉末，分別加入適量的丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的標準品，制備成供試溶液，分別測定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的含量。加樣回收率的計算公式如下：

回收率=(實際測得的含量值-樣品中有效含量)/加入標準品的含量×100%

2結果與分析

2.1高效液相色譜法方法學考察結果

從表2可知，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹酚酸B的線性回歸方程的R2分別為1、1、1和0.999 8，線性關系良好。精密度、重復性和穩定性結果顯示各成分共有峰相對保留時間的RSD均<3%，各成分相對含量的RSD均<3%，表明該高效儀器的精密性良好，方法重現性較好，有效成分穩定性較好。

丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA和丹酚酸B的加樣回收率分別為99.48%、99.92%、99.29%和99.78%。RSD分別為1.20%、0.42%、0.44%和1.26%，表明該測定方法準確度高。

表2 丹參活性成分標準品回歸方程

2.2丹參酮類含量

從表3可知，露地環境下，丹參酮Ⅰ含量，以云南沾益的丹參含量最高，為0.112 1%，云南沾益、個舊、蒙自、彌勒的丹參均顯著高于山東丹參。隱丹參酮含量，山東丹參的含量最高，顯著高于云南個舊、蒙自、沾益、彌勒丹參。丹參酮ⅡA含量，山東丹參的含量最高，顯著高于云南沾益、彌勒丹參，與云南個舊、蒙自丹參的含量差異不顯著。2015版《中國藥典》中規定，干燥品丹參中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的總含量不得低于0.25%，綜合看，露地生長環境中各樣品均未達到藥典的要求。

遮陰環境下，丹參酮Ⅰ含量，云南個舊、蒙自、彌勒的丹參含量均略高于山東丹參，云南沾益丹參酮Ⅰ含量最低，為0.056 8%；云南蒙自丹參酮Ⅰ含量最高，為0.128 8%，與云南沾益、彌勒和山東丹參之間差異顯著，與云南個舊的差異不顯著。隱丹參酮含量，云南個舊、沾益、蒙自丹參均高于山東丹參，其中，云南蒙自最高，為0.026 2%，云南彌勒丹參最低，為0.007 4%。云南蒙自的隱丹參酮的含量顯著高于云南沾益、彌勒，與云南個舊、山東丹參之間差異不顯著。丹參酮ⅡA含量，云南蒙自丹參最高，為0.272 9%，顯著高于云南沾益、彌勒，與云南個舊和山東丹參之間差異不顯著。2015版《中國藥典》中規定，干燥品丹參中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的總含量不得低于0.25%，綜合來看遮陰生長環境中，云南個舊、蒙自的云南丹參和來自山東的丹參符合2015版《中國藥典》的要求。在這5種供試樣品中，云南蒙自的丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA總含量最高，為0.427 9%。

2.3丹酚酸B含量

由表4可知，露地環境下，來自云南彌勒的丹酚酸B的含量最高，為4.199 4%，顯著高于來云南個舊和蒙自，與云南沾益、蒙自及山東丹參的含量差異不顯著。2015版《中國藥典》規定，干燥品丹參中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，來自云南沾益、蒙自、彌勒的丹參和山東丹參符合該要求。

表3不同產地不同環境丹參的丹參酮類含量

Table 3 Tanshinone content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

產地Producing area丹參酮Ⅰ含量Tanshinone Icontent露地遮陰隱丹參酮含量Cryptotanshinonecontent露地遮陰丹參酮ⅡA含量Tanshinone IIA content露地遮陰3種丹參酮總量Total amount of three tanshinones露地遮陰云南個舊 Gejiu, Yunnan0.091 3 a0.109 4 ab0.007 9 cd0.020 1 ab0.115 2 ab0.235 5 ab0.214 4 a0.365 0 a云南沾益 Zhanyi, Yunnan0.112 1 a0.056 8 b0.011 3 c0.014 5 bc0.093 7 b0.041 2 c0.217 0 a0.112 5 c云南蒙自 Mengzi, Yunnan0.084 2 a0.128 8 a0.007 9 cd0.026 2 a0.124 2 a0.272 9 a0.216 4 a0.427 9 a云南彌勒 Mile, Yunnan0.096 9 a0.092 5 ab0.006 9 d0.007 4 c0.041 9 c0.143 0 bc0.145 7 b0.242 9 b山東莒縣 Juxian, Shandong0.031 0 b0.063 0 b0.050 3 a0.013 9 bc0.138 7 a0.241 1 ab0.220 1 a0.318 1 ab

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letlers in the same column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

表4不同產地不同環境丹參的丹酚酸B含量

Table 4 Salvianolic acid B content ofS.yunnanensissamples from different producing areas under different growth environment %

產地Producing area丹酚酸B含量 Salvianolic acid B content露地遮陰云南個舊 Gejiu, Yunnan1.926 6 c3.334 0 bc云南沾益 Zhanyi, Yunnan3.114 7 abc1.700 0 d云南蒙自 Mengzi, Yunnan3.055 0 abc5.836 2 a云南彌勒 Mile, Yunnan4.199 4 a2.137 6 cd山東莒縣 Juxian, Shandong3.790 2 ab4.652 9 ab

遮陰環境下，云南蒙自丹參的丹酚酸B含量最高，為3.005 0%，顯著高云南個舊、沾益、彌勒，與山東丹參差異不顯著。2015版《中國藥典》規定，干燥品丹參中丹酚酸B的含量不能低于3.0%，云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參均符合要求。遮陰環境種植的山東丹參及云南個舊、蒙自丹參的丹酚酸B含量顯著高于露地環境的。在露地環境種植的云南沾益、彌勒的丹參丹酚酸B含量顯著高于遮蔭環境的。

3結論與討論

有效成分含量的高低是對藥用植物品質評定的重要標準。2015版《中國藥典》規定，丹參類藥材脂溶性成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的總含量不低于0.25%，水溶性成分丹酚酸B的含量不低于3%。在脂溶性成分含量方面，露地環境條件下云南丹參和山東丹參的含量均未符合2015版《中國藥典》的要求；遮陰環境條件下生長的來自云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參都符合藥典的要求，其中云南蒙自丹參含量最高，較山東丹參增加34.52%。在水溶性成分含量方面，露地環境條件下，云南沾益、蒙自、彌勒的丹參和山東丹參都符合藥典要求，其中云南彌勒的丹參含量最高，較山東丹參增加10.8%；遮陰環境條件下生長的云南個舊、蒙自的丹參和山東丹參都符合藥典要求，其中云南蒙自丹參的含量最高，較山東丹參增加25.43%。

綜合看，在品質方面，最好的是云南蒙自丹參，其脂溶性成分丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的總含量和水溶性成分丹酚酸B的含量均符合《中國藥典》2015版的要求。這與文鳳娟[11]得出的產自云南蒙自的丹參是比較優質的研究結果一致 。

研究發現，遮陰環境條件較露地種植更有利于丹參有效成分含量的積累，王自力等[12]研究發現，進行果樹和藥用植物套種，不僅可以在夏季時降低地表溫度和減少土壤水分散失，而且藥用植物還能壓制雜草，改善果園小環境。鄒平洲等[13]研究發現，林下栽培和果樹套種可提高土地空間利用率、增加土地效益，這對現代農林的發展具有重要意義。因此，可以考慮將云南丹參和山東丹參進行林下種植或與果樹等進行套作，增加有效成分積累的同時增加經濟效益。

研究表明，來自云南蒙自的云南丹參品質最好，在云南地區可以替代山東丹參種植與使用。在生產中可以將云南丹參進行合理的遮陰，以生產出優質、符合國家藥典規定的丹參藥材。