蛹蟲草培養基中多肽的提取分離工藝

雷燕妮， 張小斌*， 李多偉， 楊 梅

(1.商洛學院， 陜西 商洛 726000； 2.西北大學 生命科學學院， 陜西 西安 710069； 3.陜西富士金醫藥保健品有限責任公司， 陜西 西安 710075)

蛹蟲草〔Cordycepsmilitaris(Fr.) Link.〕別名北蟲草，屬子囊菌亞門麥角菌科蟲草屬[1]，與冬蟲夏草同屬，是一種具有滋補作用的中藥和營養品，含有大量的蛋白質、糖類、脂類、維生素和多種微量元素，及蟲草素、蟲草酸與超氧化物歧化酶(SOD)等各類生物活性物質，因此，具備提升免疫力、抗腫瘤和抗炎等功效[2-5]。楊爽等[6-7]研究發現，蛹蟲草小分子肽具有抗腫瘤、增強免疫力及抗氧化損傷等特點。蛹蟲草因其突出的功效與作用已被衛生部批準為新食品原料(2009年第3號)，其植物多肽良好的功效作用已日益受到廣大消費者青睞，國內人工栽培面積不斷擴大，已有大量藥品、保健品及食品等深加工產品上市。目前，有關蟲草素與蟲草多糖的研究屢見不鮮，但鮮見對蟲草蛋白與蟲草多肽的研究報道。鑒于此，以蛹蟲草培養基中多肽的含量為指標，采用雙因素試驗、單因素試驗和正交試驗相結合的方法[8]，對蛹蟲草培養基多肽提取工藝進行探索，旨在為蛹蟲草資源進一步開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1蛹蟲草培養基由徐州鴻宇農業科技集團提供，西北大學生命科學和醫學部鑒定。

1.1.2試劑99%牛血清白蛋白(BSA)，美國Sigma公司；乙醇、磷酸等化學試劑均為國產分析純，市購；蒸餾水，自制。

1.1.3儀器設備 ME235S電子分析天平，德國Sartorius公司；201紫外可見分光光度計，美國FISHER公司；H-H-S21-6C電熱恒溫水浴鍋，上海醫療器械五廠；RE-2000 A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-C循環水式多用真空泵，開封市宏興科教儀器廠；101A-2鼓風干燥箱，上海市實驗儀器總廠；SB-4200DT超聲清洗器，寧波新芝儀器設備有限公司；LD5-10高速離心機，北京醫用離心機廠； KRT-TU-1812-3多功能膜設備，合肥科銳特環保工程有限公司；YC-1800實驗室中藥噴霧干燥機，上海雅程儀器設備有限公司；FZ102植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1材料預處理

1) 考馬斯亮藍G-250溶液制備。精確稱量考馬斯亮藍G-250 100 mg，用50 mL 90%乙醇充分溶解，再加入100 mL 85%磷酸(W/V)，最后用蒸餾水定容至1 000 mL，均勻混合后置于棕色瓶內儲存。該溶液室溫保存有效期為30 d，使用前需用中性濾紙濾取溶液后再用。

2) 蛋白質標準溶液制備。稱取牛血清蛋白(BSA)標準品25.0 mg，加水溶解并定容至100 mL (250 μg/mL)，從中吸取40 mL用蒸餾水稀釋并定容至100 mL(100 μg/mL)得標準溶液，在4℃冰箱中保存備用。

3) 繪制蛋白含量標準曲線。參照文獻[9-12]的方法采用紫外可見分光光度計法進行測定。取6支10 mL干凈具塞試管，依次編號1～6，并設置1號試管為空白對照加入1 mL蒸餾水，其余5支試管依次添加0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL 牛血清白蛋白標準溶液，之后依次添加蒸餾水至1.0 mL。在檢測過程中，所有試管添加5 mL考馬斯亮藍溶液，并混合均勻，放置2 min，于595 nm波長條件下開始檢測，以蛋白含量(X)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，擬合蛋白質標準曲線。

1.2.2蛹蟲草培養基多肽提取溶劑及提取方法的篩選采用雙因素試驗設計，即A提取溶劑(蒸餾水)，A1～A4pH依次分別為 6.5、7.5、8.5和9.5；B提取方法，B1～B2分別為熱回流提取2.0 h，超聲(20 kHz)提取1.0 h。精確稱取蛹蟲草培養基粉末8份各50.00 g，按1∶20料液比分別加入試驗設計蒸餾水，浸泡1.0 h后在85℃水浴中分別熱回流提取或超聲提取，過濾取濾液，用稀酸或稀堿溶液調整濾液pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解溫度下攪拌酶解4 h，用2 000 Da超濾膜過濾，濾除多糖、未水解徹底的大分子成分等，濾液再經反滲透膜濃縮，濃縮液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可見分光光度計測定多肽溶液的吸光度，并計算含量。

1.2.3蛹蟲草培養基多肽的提取采用單因素試驗設計，即P提取溶劑蒸餾水pH，P1～P4依次分別為pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5及pH 9.5；T提取時間，T1～T4分別為30 min、45 min、60 min和75 min；L料液比，L1～L4分別為1∶10、1∶15、1∶20和1∶25；C提取次數，C1～C4分別為1次、2次、3次和4次。按試驗設計精確稱取蛹蟲草培養基粉末50.00 g各4份，分別置于2 000 mL燒瓶中，采用1.2.2中獲得的最佳提取方式提取與過濾，濾液用稀酸或稀堿溶液調pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解溫度下攪拌酶解4 h，用2 000 Da超濾膜過濾，濾除多糖、未水解徹底的大分子成分等，濾液再經反滲透膜濃縮，濃縮液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可見分光光度計測定多肽的吸光度并計算含量。確定不同提取條件下提取因素的變化范圍，以及各因素的最佳參數。在此基礎上采用L9(34)進行正交試驗，分析提取溶劑、提取時間、料液比及提取次數對蛹蟲草培養基內多肽提取的作用水平，進而找到最合適的提取條件。

1.3數據統計與分析

采用Excel 2003和Spss進行數據統計分析。

2結果與分析

2.1蛹蟲草培養基多肽的提取溶劑及提取方法

從圖1看出，蛹蟲草培養基多肽的超聲法提取效果均優于相同條件下的熱回流法，但二者均隨提取溶劑pH升高呈先升后降趨勢。其中，超聲法和熱回流法提取對蛹蟲草培養基多肽的提取能力均為提取溶劑pH 8.5>pH 7.5>pH 9.5>pH 6.5。二者均以蒸餾水pH 8.5條件下的提取率最高，分別為22.28%和20.75%，超聲法提取率較熱回流法高7.37%。因此，后續試驗確定采用蒸餾水pH 8.5超聲提取法進行蛹蟲草培養基多肽的提取。

圖 1不同提取方法各溶劑濃度蛹蟲草培養基多肽的提取率

Fig.1 Extraction rate of polypeptides from cordyceps militaris medium with different solvent concentrations

2.2不同因素處理蛹蟲草培養基多肽的提取率

不同因素對蛹蟲草培養基多肽提取率的影響存在差異。

2.2.1 提取溶劑pH超聲提取蛹蟲草培養基多肽的提取率隨pH增加呈先升后降趨勢，弱堿性水溶液有利于多肽的提出。最佳水溶液pH 8.5左右，其提取率為22.28%；其次pH 7.5，提取率為21.85%。

2.2.2 提取時間蛹蟲草培養基多肽超聲提取率隨提取時間延長而增加，其中，45 min后多肽超聲提取率增加緩慢，45～75 min超聲提取率為22.28%～22.30%，時間的延長大大增加能耗和用工，造成生產成本的增加，故超聲提取時間應控制在45～60 min為宜。

2.2.3 料液比蛹蟲草培養基多肽超聲提取率隨提取料液比的增加而增高，料液比1∶15時提取率為21.46%，之后多肽超聲提取率的增幅變小，1∶20～1∶25超聲提取率為22.28%～22.31%，超聲提取料液比的增加大大增加溶劑用量，并增加溶耗和后續濃縮的成本，造成生產成本的增加，故最佳超聲提取料液比確定為1∶15為宜。

2.2.4 提取次數隨提取次數的增加，提取2次、3次和4次蛹蟲草培養基多肽的超聲提取效果均較好，提取2次的提取率為22.28%，增幅較大，較提取1次(17.92%)提高4.36%；但提取次數超過2次后，提取率的增幅減小，提取3次和4次的提取率分別為22.32%和22.35%。超聲提取次數增加會延長生產周期及增加溶劑的用量，增加生產成本，因此，超聲提取次數以2次為宜。

2.3蛹蟲草培養基中多肽提取率的正交試驗

由2.2的結果確定水超聲提取蛹蟲草培養基多肽的L9(34)正交試驗方案(表1)。其中，方案6蛹蟲草培養基多肽的提取率最高，為22.26%；其次是方案5，為22.04%。從表2看出，A因素極差最大，B因素其次，D和C因素較小。表明，A因素對蛹蟲草培養基多肽提取率的影響最大，隨后為B因素、C因素和D因素。

方差分析結果顯示，A因素F值為75.206 6(F0.05F)，表明，3個因素的變化對多肽提取率的影響無顯著差異。按照不同因素k值的變化可知，A、B、C和D因素優選水平分別為2、2、2和2或1，即超聲提取蛹蟲草培養基中多肽的條件為A2B2C2D2或A2B2C2D1，提取溶劑(蒸餾水)pH 8.5，料液比1∶15，超聲提取45 min，提取1～2次。

表1水超聲提取蛹蟲草培養基多肽的L9(34)正交試驗方案與結果

Table 1 Orthogonal test scheme and results of L9(34) for extracting polypeptides fromC.militarisculture medium by ultrasound method

序號No.A(提取溶劑pH)Extraction solvent pHB(提取時間/min)Extraction timeC(料液比)Solid-liquid ratioD(提取次數/次)Extraction times提取率/%Extraction rate17.5301∶20319.6427.5451∶15221.3537.5601∶10119.3648.5301∶15121.8558.5451∶10322.0468.5601∶20222.2679.5301∶10217.3689.5451∶20118.5799.5601∶15318.05

表2 蛹蟲草培養基中多肽提取率的直觀分析

注：K，各因素某一水平結果之和；k，各因素某一水平結果之和平均值；S，偏差平方和。

Note:K, sum of results of a certain level of each factor;k, average sum of the results of a certain level of each factor;S, sum of squares of deviations.

3結論與討論

試驗結果表明，蛹蟲草培養基多肽的超聲法提取效果均優于相同條件下的熱回流法，說明，超聲提取法較傳統熱回流提取法節省溶劑消耗、節省生產用時和用工及操作簡單。蛹蟲草培養基多肽超聲提取最佳工藝參數：用pH 8.5的蒸餾水為提取溶劑，料液比1∶15，超聲提取45 min，提取1～2次。此技術條件下的提取率為21.85%～22.26%。該試驗為蛹蟲草的產業化開發使用奠定了良好基礎，同時給蛹蟲草超聲提取提供了可借鑒的數據參考。