具有納米銀合成能力菌株的篩選及其抑菌效果

王家浩， 李永磊， 黨 健， 賀劉毅， 喬 敏， 汪春蕾

(東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室， 東北林業大學 生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

銀是天然環保的、優異的廣譜殺菌劑，而且不產生耐藥性。隨著研究的深入以及納米技術的發展，納米銀以其優異的物理化學性質，在近幾年得到快速發展，而其在抑菌滅菌方面的突出功效引起了科研人員的廣泛關注[1]。納米銀粒子直徑為1～100 nm，抗菌能力很強。納米銀與銀離子相比，具有比表面積大，抑菌活性強和穩定性高等優點，已廣泛應用于醫藥載體、水質凈化、抗菌涂料和催化等領域[2]。

納米銀能穿透微生物的細胞壁，進入細菌體內，與蛋白質的巰基結合后破壞細菌的呼吸鏈，產生活性氧簇，氧化并殺死細菌[3]。與傳統物理和化學的合成方法相比，納米銀的微生物合成法是一種環境友好的可持續發展方法，具有綠色環保、低成本、低能耗、反應條件溫和等優點[4]，已經成為納米銀合成領域研究的熱點[5]。因此，篩選出新穎的具有納米銀合成能力的菌株，以擴大菌種的范圍，具有非常重要的意義。

銀離子具有較強的殺菌作用，因此只有對銀離子有較強抗性的菌株才能作為合成納米銀的菌株[4]。筆者從泥水混合樣中篩選分離到1株具有合成納米銀的芽孢桿菌屬菌株Ag2，通過透射電鏡(TEM)和X射線衍射(XRD)技術對該菌株合成的粒子進行表征，并研究了納米銀的抑菌作用，以期為新型殺菌技術提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品泥水混合樣采自黑龍江省哈爾濱市馬家溝東北林業大學流段。

1.1.2試劑細菌基因組DNA提取試劑盒(Bacteria DNA Kit)、Taq DNA Polymerase和E.coliDH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司；細菌微量生化反應管購買于杭州濱和微生物試劑有限公司；Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA Marker DL2000、dNTP和pMD18-T載體購自TaKaRa公司；16S rDNA通用引物27F和1492R由華大基因公司合成；其余常規試劑為國產分析純制品。

1.1.3培養基液體選擇培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，pH 7.0。固體選擇培養基：0.7 mmol/L AgNO3，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.0。

1.2菌種篩選與鑒定方法

1.2.1菌種篩選稱量泥水混合樣3 g，加至30 mL蒸餾水中制成懸濁液，取懸濁液3 mL接種至液體選擇培養基中，150 r/min，避光，30℃培養2 d，傳代培養于含0.1 mmol/L AgNO3的液體選擇培養基中，150 r/min，避光，30℃培養2 d，取菌體培養液2.0 mL分別接種至AgNO3濃度為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L和0.9 mmol/L的液體選擇培養基中，150 r/min，避光，30℃培養7 d。將生長在含0.7 mmol/L AgNO3培養基中的菌液涂布于固體選擇培養基上，避光，30℃培養2 d。將長勢良好的單克隆劃線純化培養3次[6]。

1.2.2菌種鑒定選取長勢良好的菌株Ag2進行革蘭氏染色，并利用生理生化反應管測定菌株Ag2對糖的利用及各種生理生化反應特性[7]。

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株Ag2的基因組DNA，以菌株Ag2基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物擴增菌株Ag2的16S rDNA基因[8]。PCR體系和反應條件見參考文獻[9]，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收16S rDNA片段?；厥盏?6S rDNA與pMD18-T載體連接，轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，連接體系、轉化及反應條件見參考文獻[10]。

轉化子用氨芐青霉素篩選后，將經菌落PCR鑒定為陽性的單克隆送至華大基因有限公司進行16S rDNA測序。利用CExpress對所測得的原始序列進行拼接，在NCBI官網進行BLAST分析，用Phylip-3.69中的最大簡約法構建基于16S rDNA序列菌株Ag2的系統發育樹[11]。

1.3菌株Ag2合成產物的提取與表征

向菌液中連續3 d分3次補加AgNO3，使培養液中Ag+終濃度為0.7 mmol/L，37℃繼續培養1 d。離心菌體培養液，將菌體沉淀和培養液上清(樣品1)分離，無菌水洗滌菌體沉淀3次，去除附著的有機物。向菌體沉淀中加20 mL無菌水，超聲波破胞，功率200 W，工作與停止各15 s交替進行30 min，離心后分別收集破胞后的上清(樣品2)和沉淀(樣品3)。使用透射電子顯微鏡檢測樣品1、樣品2和樣品3。樣品3經真空干燥后，進行XRD檢測分析。

1.4納米銀粒子抑菌效果

取大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種于LB培養基中培養過夜，將培養后的菌液稀釋1000倍，取100 μL稀釋后的菌液涂布于LB固體平板上，用黃色槍頭在平板上打2個孔，向2個樣品孔中分別加入40 μL無菌水和40 μL 50 mg/mL的樣品3，37℃培養過夜，觀察抑菌效果。

2結果與分析

2.1篩選菌種

樣品經篩選、分離和純化后得到5個單菌落，其中菌株Ag2長勢最好，可用于試驗。菌株Ag2在含0.1～0.9 mmol/L AgNO3的選擇培養基中均有生長，AgNO3濃度大于0.5 mmol/L的培養液顏色由黃色變為黑色，納米銀溶于水時的顏色為黑色[12]，表明該菌株具有合成納米銀的能力。

2.2鑒定菌種

2.2.1形態鑒定菌株Ag2的菌落為白色，圓形且表面光滑，革蘭氏染色結果呈紫色(圖1)，為革蘭氏陽性桿菌。菌株Ag2可以利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和麥芽糖作為碳源，具有淀粉水解酶、硝酸鹽還原酶、馬尿酸水解酶和精氨酸雙水解酶的活性(表1)。

圖1 菌株Ag2革蘭氏染色形態(×1 000)

表1 菌株Ag2的生理生化反應

注：+表示陽性反應，-表示陰性反應。

Note:+ indicates positive and - indicates negative.

2.2.2分子鑒定以提取菌株Ag2的總DNA為模板，克隆的16S rDNA條帶清晰明亮，長度約1 500 bp，無非特異性擴增條帶(圖2)。經測序，菌株Ag2的16S rDNA大小為1 513 bp，提交Genbank后的序列號為MK920167。在NCBI上經BLAST比對分析，菌株Ag2的16S rDNA序列與多種芽孢桿菌屬的細菌具有較高相似度，確定該菌株屬于芽孢桿菌屬。由圖3可見，菌株Ag2與枯草芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌聚為一類。

注：M，分子量標準DL2 000；泳道1，空白對照；泳道2，樣品。

Note: M,DL2 000 marker; Lane 1, blank control; Lane 2, sample.

圖2菌株Ag2的16S rDNA的PCR電泳圖譜

Fig.2 PCR electrophoresis of 16S rDNA of strain Ag2

圖3 基于16S rDNA序列菌株Ag2的系統發育樹

2.3菌株Ag2合成納米銀粒子的表征

菌株Ag2與AgNO3共培養后在透射電鏡下均可觀察到納米粒子，分散性良好。菌體破胞沉淀樣品(樣品3)中粒子的密度和粒徑(圖4A)均大于培養液上清(樣品1)與破胞后上清樣品(樣品2)中的納米粒子(圖4B、C)，粒徑在10～20 nm，在高倍鏡下可清晰地觀測到樣品3中粒子的晶格結構(圖4D)，其晶格條紋間距為0.229 nm，與Jade 6.5提供的PDF#04-0783卡片中納米銀晶體數據相符。從菌體破胞沉淀樣品(樣品3)的X射線衍射分析圖譜(圖5)可看出，菌株Ag2合成納米銀的晶面指數包含(111)、(200)、(222)和(311)4種類型，為多晶結構，且以(111)型納米銀含量最多。

注：A和D，菌體破胞沉淀樣品(樣品3);B,培養液上清(樣品1) ;C,破胞后的上清樣品(樣品2)。

Note: A and D, precipitatesample after cell broken (sample 3); B,culture solutionsupernatant (sample 1); C,supernatant sample after cell broken (sample 2).

圖4透射電鏡下菌株Ag2制備的納米粒子

Fig.4 Nanoparticles prepared by strain Ag2 under transmission electron microscopy

圖5 XRD鑒定菌株Ag2合成的納米銀

Fig.5 Silver nanoparticles synthesized by strain Ag2 under XRD

2.4納米銀粒子的抑菌效果

菌株Ag2胞內合成的納米銀粒子對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌能力(圖6)，表現出很強的應用潛力。

注：A，大腸桿菌;B,枯草芽孢桿菌;樣品孔1,樣品3;樣品孔2,無菌水。

Note: A,Escherichiacoli;B,Bacillussubtilis; sample hole 1,sample 3; sample hole 2, sterile water.

圖6菌株Ag2胞內合成納米銀的抑菌效果

Fig.6 Antibacterial effect of silver nanoparticles intracellular synthesised by strain Ag2

3結論與討論

研究利用篩選出的芽孢桿菌屬菌株Ag2與AgNO3共培養，在菌體細胞內部大量合成了納米銀粒子，其粒徑在10～20 nm，晶面條紋間距為0.229 nm，與納米銀(111)的晶面間距相符，納米銀粒子對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有抑菌效果。

利用化學法制備納米粒子具有一定的毒性，而生物法制備納米粒子，綠色環保，認可度高[13]。細菌合成納米銀粒子主要有菌液胞內合成與培養上清液胞外合成2種方式[4]，菌株Ag2的胞內外均合成了納米銀，菌株Ag2與AgNO3共培養后，培養液變為黑色，表明有納米粒子的合成，但透射電鏡結果表明，胞外合成的納米粒子密度及粒徑均小于菌體細胞內合成的納米粒子。菌株Ag2具有硝酸鹽還原酶的活性，推測其與納米銀的合成有關[14]。

單質銀具有殺菌功能，而納米銀粒子比表面積大，粒徑小，與細菌的接觸幾率大，具有更強的殺菌能力。菌株Ag2胞內合成的納米銀粒子對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌效果。抑菌環是納米銀粒子殺菌效果的直接證明[15]。研究篩選出的菌株Ag2提供了生物合成納米銀的新菌株，利用菌株Ag2進行生物方式合成的納米銀粒子具有抗菌應用潛力。