百合莖尖培養材料的篩選及其組培配方的優化

吳青青， 王維澤， 崔 嵬， 石樂娟， 李正麗，文林宏

(貴州省農業科學院 園藝研究所/貴州省園藝工程技術研究中心， 貴州 貴陽 550009)

百合(Liliumspp.)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生球根花卉，其花朵典雅對稱，花色艷麗多變，深受廣大消費者的喜愛，是當前世界花卉市場的主流切花產品之一，具有重要的經濟價值[1-3]。世界范圍內百合相關行業已經形成了龐大而復雜的產業鏈，荷蘭依靠其在種質資源創新、雜交育種、商品球生產繁育等上游領域的壟斷性技術、資源優勢，獲得了可觀的經濟利益。我國目前使用的切花百合種球主要從荷蘭進口，每年進口數量超過3億粒，并且呈逐年快速增加趨勢[4-10]。隨著進口種球的輸入，大量百合病毒病也被傳播到中國，以車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus,PLAMV)為例，此病毒2010年被荷蘭報道在百合上發現侵染，隨后即在美國、中國臺灣等地檢出，2018年對北京40個百合樣品進行PLAMV檢測，檢出率為12.5%。在荷蘭，車前草花葉病毒已經成為侵染百合種球的主要病毒病之一[11]。

目前，我國的切花百合病毒病發病率越來越高，1代球情況較好，2代球、3代球病毒病發病率高達80%，已成為提高百合切花品質、產量的重要障礙。最為嚴重的是種球國產化領域，由于未能很好地解決病毒病問題，已經嚴重制約了百合產業的發展[12-13]。控制病毒病的傳播目前最有效的做法是種苗脫毒，較為常用的脫毒方法有莖尖培養、抗病毒藥劑處理、愈傷組織脫毒及熱處理等。莖尖培養是利用頂端分生組織來獲得再生植株，由于頂端分生組織無毒，所以莖尖培養經常被用于種苗脫毒，是一種簡單、廉價、有效的脫毒方式[14-18]。為緩解百合病毒病發病率越來越高的現狀，筆者等通過比較不同來源的培養材料，篩選適宜百合莖尖培養的種源及其適宜的組培配方，旨在深入掌握百合莖尖脫毒技術，為百合脫毒苗的大批量生產提供技術支撐，以提高百合的品質與產量。

1材料與方法

1.1材料

供試品種為東方百合品種卡瓦娜(Corvara)，供試材料為卡瓦娜不同處理的組培苗與種球共3組材料。A組，未經處理的組培苗；B組，經過4℃低溫處理40 d后打破休眠的組培苗；C組，商品球，經低溫處理后直接栽種于基質中。供試材料均由貴州省農業科學院園藝研究所提供。

1.2方法

1.2.1適宜莖尖培養種源的篩選A、B組百合組培苗，去除外部鱗片直到裸露出內部嫩葉，在體視鏡下使用刀片與解剖針將嫩葉剝去，觀察莖尖。C組百合商品球，芽從基質長出后，地上部分長至10 cm左右時將芽切斷，剝去嫩葉，將莖尖置于體視鏡觀察。通過對生長點與葉原基的觀察與判斷，篩選適宜脫毒莖尖培養的種源。

1.2.2百合莖尖培養基激素組合篩選使用適宜莖尖培養的B、C組材料進行試驗。切0.3～0.5 mm的莖尖置于培養基上進行培養。以6-BA的3個濃度水平(0.5 mg/L、1.0 mg/L和1.5 mg/L)和NAA的2個濃度水平(0.25 mg/L和0.5 mg/L)進行6個培養基配方組合，配制培養基為：MS+6-BA+NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH5.8，培養90 d后統計試驗結果。B、C組材料各接種5個莖尖，3次重復。通過比較分析不同處理的培養效果，篩選適宜百合莖尖培養的培養基激素組合。

1.2.3培養基糖濃度的篩選由于60 g/L的蔗糖濃度在百合組培中有利于不定芽的生長，故以1.2.2篩選出的培養基作為基礎配方(蔗糖30 g/L，CK)，提高蔗糖濃度至60 g/L，對C組材料莖尖進行培養，每個培養基各接種5個莖尖，3次重復。通過比較分析不同蔗糖濃度(蔗糖30 g/L與60 g/L)處理的培養效果，篩選適宜百合莖尖培養的培養基糖濃度。

2結果與分析

2.1適宜脫毒莖尖培養的百合種源選擇

2.1.1A組材料的莖尖生長情況對A組培苗進行莖尖觀察可知，其小種球直徑在1 cm左右，撥開層層鱗片后，觀察到靠近基盤位置的小芽(圖1)，其外部被嫩葉包裹，長度為2.5 mm。撥開嫩葉后可見生長點位于底部基盤上，呈圓錐形，生長點的高度為0.2 mm左右，重復剝開幾個小球莖進行觀察，總體情況差別不大。從生長點情況看，未見葉原基等其他結構，可能這些分生組織尚不具備立刻發育成莖的能力，結合百合自身特點，推測這些百合鱗莖處于休眠狀態。因為百合對溫度敏感，在20℃以上的組培室中長時間生長會越來越趨向休眠狀態，其底部基盤上不斷分生出新的鱗片，但是其莖尖生長點不會向上生長。從A組莖尖的實際情況看，未經處理的組培苗不適宜作為莖尖培養的材料使用。

2.1.2B組材料的莖尖生長情況對經低溫處理的組培苗進行觀察，剝開鱗片后可看到2種情況。

1) 生長點與葉原基生長好，芽結構完整。小種球內的莖已經開始萌發伸長，嫩葉層層分布，其莖尖位置明顯，頂端為嫩葉包裹的生長點，去掉嫩葉后即可見生長點與葉原基，芽結構完整，頂端生長點活動旺盛(圖2)。說明，部分經低溫處理的百合組培苗適宜進行莖尖培養，此類材料占總數的33.3%。

注：a,包裹生長點的嫩葉;b,生長點俯視圖;c,生長點側視圖。

Note: a, tender leaves wrapped around the growing point; b, top view of the growing point; c, side view of the growing point.

圖1A組材料的莖尖觀察

Fig.1 Observation on stem tip of Group A

注： a,伸長的莖尖; b, 包裹生長點的嫩葉; c,莖尖。

Note: a, elongated stem tips; b, tender leaves wrapped around growing points; c, stem tips.

圖2B組材料的莖尖觀察(有葉原基的材料)

Fig.2 Shoot tip observation of group B materials (with leaf primordium)

2) 莖尖周圍未見葉原基。部分組培苗頂芽并未快速生長，葉片從鱗莖包裹的中心部位長出，剝開鱗片后露出新葉基部(圖3a)，去除葉片后露出柱狀莖尖(圖3b)，長度約1.8 mm，莖尖位置靠近基盤，類似于A組材料莖尖，只是長度有一定增加，說明其有一定的生長，莖尖周圍未見葉原基。通過觀察判斷，這類材料莖尖分生組織不活躍，不適宜進行莖尖培養，在進一步試驗中不采用此類材料。

注：a,新生嫩葉;b,裸露得莖尖;c,剝下的莖尖。

Note: a,newborn leaves; b, bare tips; c, peeled tips.

圖3B組材料的莖尖觀察(無葉原基的材料)

Fig.3 Stem tip observation of group B materials (without leaf primordium)

2.1.3C組材料的莖尖生長情況去除種球萌發出的芽上層層葉片，在體視鏡下觀察莖尖，可見最后一層小葉包裹的莖尖、生長點、葉原基等(圖4)。C組材料莖尖部位明顯且生長旺盛，莖尖剝離等操作難度低，說明經低溫處理的百合商品球最適宜作為莖尖培養的材料。

注：a,剝開葉片的芽尖端; b,莖尖側視圖; c, 莖尖俯視圖。

Note: a, bud tip of peeled leaf; b. side view of the stem tip; c, top view of the stem tip.

圖4C組材料的莖尖觀察

Fig.4 Stem tip observation of group C materials

2.2適宜百合莖尖培養的培養基激素組合

2.2.1成活率從表1看出，B組材料中6-BA 1.0 mg/L和1.5 mg/L與NAA 0.50 mg/L組合的培養苗成活率最高，為53.3%；C組材料中，6-BA 1.5 mg/L與NAA 0.50 mg/L組合的培養苗成活率最高，為60%。說明高濃度的6-BA與NAA有利于提高莖尖培養的幼苗成活率。

2.2.2愈傷組織6-BA 1.5 mg/L與不同濃度NAA組合，均可獲得較多的愈傷組織(表1)，其中，B組材料中6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L獲得8個愈傷組織；其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L組合，獲得6個愈傷組織；C組材料中，6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.50 mg/L獲得9個愈傷組織，其次是6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L組合，獲得8個愈傷組織。

2.2.3不定芽和成苗數從表1看出，在B組材料和C組材料中，均以6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L組合獲得的不定芽數最多，均為8個；成苗數最高，均7株。從成活率與成苗數綜合看，6-BA 1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L組合配制的培養基(MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8)培養效果最好，可以用于下一步試驗。

表1 不同濃度激素培養基的培養效果

2.3培養基適宜的糖濃度

在組織培養中，蔗糖作為培養基中碳與能量的主要來源，為組培苗的生長提供基礎條件，多數情況下，適當提高蔗糖濃度能夠促進植株的生長與發育。從表2看出，蔗糖濃度30 g/L的培養基對莖尖培養的效果略優于蔗糖濃度60 g/L的培養基。說明，較高的糖濃度未表現出對百合莖尖生長的促進作用，甚至弱于低濃度配方，從實際效果看，蔗糖濃度30 g/L更適合百合莖尖培養。因此，百合莖尖培養適宜的組培配方為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8。

表2不同糖濃度培養基效果比較

Table 2 Effects comparison of media with different sugar concentration

蔗糖濃度/(g/L)Sucrose concentration成活率/%Survival rate愈傷組織總數/個Total number of callus obtained不定芽總數/個Total number of adventitious buds成苗數/株Number of seedlings30 46.7 07760 33.3 055

3結論與討論

研究表明，百合未經處理的組培苗、經低溫處理的組培苗和商品球3組材料中，適宜進行莖尖培養的種源是經低溫處理的組培苗和商品球，尤以經低溫處理的商品球培養效果最佳。通過不同濃度激素和蔗糖組配試驗得到百合莖尖培養的適宜激素組合及蔗糖濃度，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+活性炭1 g/L(pH 5.8)為百合莖尖培養的最適培養基。

莖尖培養是病毒病脫除中最常見的方法，具有成本低廉、操作簡便等優點。當前在百合脫毒方面，為了保證脫毒效果，通常都是幾種脫毒方法結合使用，比如采用熱處理+莖尖培養、莖尖培養+病毒唑處理等。總體來看，其脫毒的核心是通過無毒莖尖來獲得脫毒苗。莖尖脫毒的原理源自于莖尖分生組織無毒，其主要障礙在于莖尖生長點太小，其厚度不超過0.1 mm，因此難以獲得且培養難度大，通常進行的莖尖培養為了方便操作都是切取頂端生長點與葉原基一起培養，這樣可能造成材料依然帶毒。綜合看，通過徹底的頂端生長點培養可以完全解決問題，所以可以嘗試進一步研究。

研究在培養基中添加了活性炭，因為在百合組織培養中活性炭在預防褐化等方面確實有一定的作用，但是其缺陷是容易造成組培苗生長緩慢，因此，在培養基中添加活性炭還需再斟酌。