狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkCHY)的生物信息學分析

陳 鑫， 李然紅， 劉 丹， 王立鳳， 劉思言

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157012)

鋅是植物必需的微量營養元素之一，鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFP)主要由半胱氨酸和組氨酸殘基與Zn2+結合成立體結構[1]，且具有指狀結構特征，RING-ZFPs是典型的鋅指結構蛋白類型，具有保守結構域[2]。現已知鋅指蛋白廣泛分布在真核生物體中，在擬南芥植物中現已發現有176 種Cys 2 His 2型鋅指蛋白[3]。低溫、干旱等逆境脅迫能夠誘導植物體內一些鋅指蛋白基因發揮作用增強植物逆境脅迫能力。狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕主要分布于我國東北、四川、河北、云南等地。其葉片顏色在生長的不同時期會發生變化，形成白色或紫紅色彩葉，遠觀如桃花盛開又如梨花片片，極具觀賞價值，其果實柔軟多汁、酸甜可口、富含維生素C，是一種藥食觀賞兼用植物[4-6]，屬于大型落葉藤本植物。RING型基因能夠在擬南芥、煙草、辣椒、草莓、水稻等多種植物中鑒定出來，并在植物的生長發育、激素的信號傳導及響應非生物脅迫等方面起到關鍵作用。KO等[7]研究表明,在擬南芥超表達RING時能夠引起耐鹽性的降低;GAO等[8]通過調節RING型基因改變ABA信號傳導可以提高水稻的抗旱性；CHAE等[9]發現沉默CaAIRF1基因后的辣椒其ABA敏感性降低，干旱耐受性減弱。另外，LEE等[10]研究發現,擬南芥中的RING型基因表達變化時，其植株的凍害敏感性也發生變化。高溫處理下植物葉肉細胞中的RING型基因能夠調控H2O2的積累，進而提高植物的耐高溫性[11]。目前，狗棗獼猴桃CHY基因的研究未見報道。因此，以狗棗獼猴桃轉錄組數據為參考，篩選到狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkCHY)的cDNA序列，利用生物信息學方法對狗棗獼猴桃蛋白的理化性質、疏水性/親水性、結構功能域、蛋白質修飾位點及同源性等方面進行預測和分析，為狗棗獼猴桃鋅指蛋白(AkCHY)功能的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃AkCHY基因cDNA序列從牡丹江師范學院植物分子育種實驗室轉錄組數據中獲得；中華獼猴桃變種(Actinidiachinensisvar.chinensis PSS 14254.1)、茶樹(CamelliasinensisXP_028125452.1)、毛果楊(PopulustrichocarpaXP_002314304.1)、胡楊(PopuluseuphraticaXP_011032318.1)、橡膠樹(HeveabrasiliensisXP_021692080.1)、川桑(MorusnotabilisXP_024022996.1)、榴蓮(DuriozibethinusXP_022730070.1)、麻瘋樹(JatrophacurcasXP_012064689.1)、大桉(EucalyptusgrandisXP_010031414.1)、葡萄(VitisviniferaRVW54207.1)、番木瓜(CaricapapayaXP_021908000.1)、棗樹(ZiziphusjujubaXP_015898513.1)、歐洲栓皮櫟(QuercussuberXP_023888973.1)、木薯(ManihotesculentaOAY51516.1)、石榴(PunicagranatumOWM68934.1)等15種植物氨基酸序列在NCBI數據庫中下載。

1.2 方法

AkCHY的理化性質用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進行分析；NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)預測功能位點；NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對N-糖基化位點進行預測；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對O-糖基化位點進行預測；采用PredictProtein 數據庫(https://www.predictprotein.org/)對AkCHY進行二級結構及蛋白質修飾位點預測；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預測蛋白質三級結構。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中獲得15條不同植物的CHY氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構建蛋白質系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 AkCHY的理化性質

經分析表明，AkCHY基因cDNA全長為1 768 bp，編碼區(CDS)為cDNA上第238～1 074個堿基，共編碼279個氨基酸，分子量32 324.16 D，理論等電點為7.01，負電荷殘基總數(Asp+Glu)為37，正電荷殘基總數(Arg+Lys)為36，分子式為C1369H2125N413O407S45，總原子數4 359，不穩定指數(instability index,Ⅱ)為54.356，脂肪系數(Aliphatic index)為54.44，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.527。說明該蛋白為親水非穩定性蛋白。該蛋白中含量最多的為半胱氨酸，占11.8%；其次為組氨酸，占7.5%；含量最少的為色氨酸，為0.4%(圖1)，吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量為0。通過ProtScale分析預測(圖2)，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為1.967，在158個氨基酸處；最小值為-2.522，在第59個氨基酸處。從整體分布看，氨基酸的負值多且分值大，根據蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。結合理化性質分析得出該AkCHY基因為非穩定親水蛋白。

圖1 AkCHY基因編碼蛋白質的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHYgene

圖2 AkCHY的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHY

2.2 AkCHY的信號肽及跨膜結構

經SignalP-4.1預測AkCHY蛋白不含信號肽(圖3)，同時不存在跨膜結構。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點、信號肽和綜合剪切位點的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkCHY的蛋白信號肽

Fig.3 Signal peptide of AkCHY

2.3 AkCHY的結構域

對AkCHY保守序列及蛋白家族預測(圖4)表明,AkCHY是ZFP基因家族的ZF-CHY和zinc-ribbon-6成員(ID：11342810)，第18～100個氨基酸的序列區域為ZF-CHY組的保守結構域，第201～259個氨基酸的序列區域含有zinc-ribbon-6的鋅帶結構。另外，152～204個氨基酸存在RING-H2-Pirh2、RING-H2、RING-H2-BRAP2、HRD1、RING-H2-RNF24、COG5540、RING-Ubox等保守結構域。

圖4 AkCHY的蛋白保守序列

Fig.4 Conservative protein sequence of AkCHY

2.4 AkCHY的二級、三級結構

對AkCHY的二級結構進行分析預測，該蛋白14%可能會形成螺旋，10%可能形成延伸鏈，76%為無規卷曲，無二硫鍵的形成，無特殊的二級結構。用SWISS-MODEL對AkCHY蛋白進行三級結構預測(圖5)，該三級結構含有多個功能結構域，在第202～263個氨基酸的序列區域含有zinc-ribbon-6的鋅帶結構域，第5～146個和第147～238個氨基酸均有RING-H2保守結構。

圖5 AkCHY蛋白的三級結構

Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHY protein

2.5 AkCHY的蛋白質修飾位點

對蛋白磷酸化位點預測，該蛋白存在磷酸化位點18個(圖6)。對O-糖基化位點進行預測，預測分數均大于0.5，因此未陽性，故推測該蛋白內含5個O-糖基化位點分別在第3、48、265、268、267個氨基酸。由表1可見，AkCHY含有2個蛋白激酶磷酸化位點分別在第13、164個氨基酸處，4個酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點分別在第3、74、164、199個氨基酸處，4個十四烷酰化位點分別在第86、115、132、263個氨基酸處。

2.6 AkCHY的氨基酸序列同源性

AkCHY氨基酸序列與15種植物的CHY序列進行同源性分析(圖7)表明，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關系較近，而與番木瓜等植物的親緣關系較遠。

圖6 AkCHY蛋白的磷酸化位點

Fig.6 Phosphorylation site prediction of AkCHY protein

表1 AkCHY的修飾位點

圖7 CHY系統進化樹

Fig.7 System phylogenetic tree of CHY

3 結論與討論

鋅指蛋白作為真核生物中分布最廣泛的基因調控因子，直接或間接參與植物的生長發育、根系建成、逆境響應及信號調節等生理生化過程，根據半胱氨酸和組氨酸殘基的數目和位置分為C2H2、C4、C6、C4HC3等多種類型，根據功能結構分為PHD、DOF、RING型，在植物中具有高度保守基因序列。CHY基因含有RING型結構功能，與植物生長發育及非生物脅迫抗性功能相關，擬南芥中發現的RING型鋅指蛋白基因與植物側根發育有密切關系，同時還具備抗旱能力[12]。研究通過生物信息學方法得到AkCHY基因的基本理化性質及結構功能：該基因cDNA全長為1 768 bp，由279個氨基酸編碼構成，通過理化性質及ProtScale分析出該蛋白為非穩定親水性蛋白，無跨膜結構，二級結構主要構件為α-螺旋和不規則卷曲，三級結構中包含RING型結構及zinc-ribbon-6的鋅帶結構域，選取15條CHY氨基酸序列與AkCHY進行比對，經MAGA5.1分析，狗棗獼猴桃與中華獼猴桃原變種的親緣關系較近，而與番木瓜等植物的親緣關系較遠。研究結果為進一步研究狗棗獼猴桃鋅指蛋白CHY基因功能提供理論基礎。