圓珠半夏帶頂芽塊莖組培快繁體系的構建

朱 健， 羅夫來， 趙 致， 王華磊， 羅春麗， 李金玲， 劉紅昌， 黃明進

(1.貴州大學 農學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省中藥材繁育與種植重點(工程)實驗室， 貴州 貴陽 550025)

半夏是我國傳統中藥材，有燥濕化痰、鎮吐及催吐、抗腫瘤、抗早孕等作用[1-3]。大方圓珠半夏是貴州省大方縣境內種植或野生的半夏(Pinelliaternata)，為天南星科植物，具有個大色白、棕眼明顯、質地堅實、粉性足等特點，屬于半夏優質藥材。2012年獲得國家地理標志產品保護認證。大田種植主要用塊莖播種，用種量大，種子成本高，對半夏藥材生產造成較大限制。而基于植物組織培養的快繁技術，具有速度快、成本低、效率高等優點，在種苗繁育研究中被廣泛應用。半夏葉片、葉柄、塊莖都可以作為外植體用于組培快繁，且已有較多文獻報道。筆者所在課題組在進行半夏組培快繁研究時發現，以半夏塊莖頂芽或帶頂芽的塊莖切塊為外植體時，其組織培養快速繁殖所需要的條件與葉片、葉柄、不帶頂芽塊莖所需的生長調節劑濃度及其組合完全不同。為此，筆者等以圓珠半夏帶頂芽塊莖為外植體開展了頂芽萌發、愈傷組織和叢生芽誘導等研究，以期為豐富半夏組培快繁資料及半夏種苗繁育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

圓珠半夏：采自貴州省大方縣，為人工種植，經鑒定為天南星科植物半夏(Pinelliaternata)。

1.2 方法

以MS培養基為基本培養基，考察不同生長調節劑及其比例對外植體和培養物的影響。

1.2.1 試驗設計

1) 單因素試驗。以蒸餾水為對照，分別研究不同濃度6-BA、NAA、2,4-D對外植體形成愈傷組織的效應。其中，生長調節劑6-BA 的濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L和2.0mg/L，NAA的濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L，2,4-D的濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L和0.8 mg/L。

2) 正交試驗設計。在單因素試驗的基礎上，以6-BA濃度(A)、NAA濃度(B)和2,4-D(C)為考察因素，設置4個水平，采用L16(43)正交試驗篩選俞傷組織形成、誘導頂芽萌發和叢生芽形成的生長調節劑最佳組合。其因素水平見表1。

表1 圓珠半夏帶頂芽塊莖組培的生長調節劑因素及水平

Table 1 Factors and levels of growth regulators in tissue culture ofP.ternatawith apical buds

水平Level6-BA/(mg/L)NAA/(mg/L)2,4-D/(mg/L)10 0 0 20.80.10.131.00.20.241.20.30.3

1.2.2 外植體準備、接種與培養 外植體準備：選取無病蟲害健壯飽滿的圓珠半夏塊莖，剝去表皮，用清水沖洗3～5 min，在無菌工作臺上用75%酒精消毒40 s，用無菌水沖洗2～3次，用0.1%升汞滅菌12～15 min，再用無菌水沖洗3～5次，置滅菌濾紙上吸干水分，備用。

接種與培養：每個生長調節劑處理接種10瓶，每瓶接種3塊帶頂芽塊莖。培養條件為25℃，空氣相對濕度80%，光照強度2 000～2 500 Lx，光照時間15 h/d，培養30 d后觀察。

1.2.3 指標測定 觀測并記錄不同處理圓株半夏頂芽塊莖的芽萌發數，形成愈傷組織數及從生芽數，并計算芽萌發率及愈傷組織形成率。

萌發率=芽萌發數/接種數×100%

愈傷組織形成率=形成愈傷組織數/接種數×100%

2 結果與分析

2.1 不同濃度生長調節劑對圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織的誘導效應

2.1.1 6-BA 6-BA對圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有促進作用，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，誘導形成的愈傷組織數最多，達26塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，顯著優于其余處理；其余各處理形成的愈傷組織均在20塊以下，且愈傷組織狀態較差(表2)。因此，6-BA誘導帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為1.0 mg/L。

表2 不同濃度生長調節劑的對圓珠半夏頂芽外植體形成愈傷的誘導效應

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level.

2.1.2 NAA NAA對圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有顯著促進作用，且NAA各濃度處理誘導的愈傷組織數均顯著高于對照。當NAA濃度為0.2 mg/L時，誘導的愈傷組織數最多，達29塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，優于其余處理，但不同濃度間差異不顯著(表2)。因此NAA誘導帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為0.2 mg/L。

2.1.3 2,4-D 2,4-D對圓珠半夏帶頂芽外植體形成愈傷組織有促進作用，除0.8 mg/L以外，其余各濃度2,4-D處理均顯著優于對照。當2,4-D濃度為0.2 mg/L時，誘導外植體形成的愈傷組織數最多，達24塊，且愈傷組織呈綠色，表面有較多凸起的小顆粒，優于其余處理，但不同濃度間差異不顯著;其余各處理形成的愈傷組織數均在20塊以下，且愈傷組織狀態較差(表2)。因此，2,4-D誘導帶頂芽外植體形成愈傷組織的最適濃度為0.2 mg/L。

2.2 不同生長調節劑組合對圓珠半夏組織培養的促進作用

2.2.1 塊莖頂芽萌發 由表3可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導頂芽萌發的最優水平分別為A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L和2,4-D 0.2 mg/L。經方差分析表明，6-BA、NAA不同濃度誘導圓珠半夏的頂芽萌發數差異達顯著水平，2,4-D不同濃度誘導圓珠半夏的頂芽萌發數差異達極顯著水平。經多重比較表明，A4萌發數最多，A2、A3、A4均極顯著高于A1，但A2、A3、A4之間差異不顯著；B4萌發數最多，極顯著高于B1、B2和B3，B1和B3極顯著高于B2，B1與B3差異不顯著；C3萌發數最多，極顯著高于C1、C2和C4， C2極顯著高于C1和C4，C1與C4差異不顯著。因此，在以MS為基本培養基，促進頂芽萌發的最優生長調節劑水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。

表3 不同生長調節劑組合對圓珠半夏頂芽塊莖萌發的促進作用

注：K，各因素某一水平芽萌發數結果之和。

Note:Kindicates the sum of bud germination number of each factor at certain level.

2.2.2 愈傷組織 由表4可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導愈傷組織形成的最優水平分別為A3、B4和C3，即6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.3 mg/L。經方差分析表明，6-BA各濃度誘導帶頂芽塊莖形成愈傷組織塊數差異達顯著水平。NAA和2,4-D各濃度誘導帶頂芽塊莖形成愈傷組織塊數差異不顯著。經多重比較表明，A3誘導的愈傷組織塊數最多，極顯著高于A1、A2和A4，A3、A4極顯著高于A1、A2，A2極顯著高于A1。NAA和2,4-D各水平誘導愈傷組織數差異不顯著，最優水平可選愈傷組織數最多的B4和C4。因此，以MS為基本培養基，誘導帶頂芽塊莖形成愈傷組織的最優生長調節劑水平組合為A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。

表4 生長調節劑組合誘導圓珠半夏帶頂芽塊莖形成的愈傷組織情況

注：K為各因素某一水平形成愈傷組織數之和。

Note:Kindicates the sum of callus number of each factor at certain level.

2.2.3 叢生芽 由表5可知，6-BA(A)、NAA(B) 和2,4-D(C) 誘導帶頂芽塊莖形成叢生芽的最優水平分別為A4、B4和C3，即6-BA 1.2 mg/L、NAA 0.3 mg/L、2,4-D 0.2 mg/L。經方差分析表明，6-BA、NAA、2,4-D各濃度誘導叢生芽數差異達極顯著水平。經多重比較表明，A4誘導叢生芽數最多，極顯著高于A1、A2、A3，A3極顯著高于A1、A2，A2極顯著高于A1；B4誘導叢生芽數最多，極顯著高于B1、B2和B3，B1極顯著高于B2和B3， B3極顯著高于B2；C3誘導叢生芽數最多，極顯著高于C1、C2和C4，C2極顯著高于C1和C2，C1與C4差異不顯著。表明，以MS為基本培養基，誘導叢生芽的最優生長調節劑水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。

表5 生長調節劑組合對圓珠半夏帶頂芽外植體叢生芽的誘導效應

注：K為各因素某一水平的從生芽數之和。

Note:Kindicates the sum of apical bud number of each factor at certain level.

3 結論與討論

半夏組織培養一般使用6-BA、NAA及2,4-D等調節劑經過數次繼代完成[4-7]。試驗表明，以圓珠半夏帶頂芽塊莖為外植體進行組織培養時，不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D及其組合對頂芽萌發、愈傷組織和叢生芽誘導具有顯著或極顯著促進作用。以MS為基本培養基，誘導圓珠半夏帶頂芽塊莖形成愈傷組織時，生長調節劑最優水平組合為A3B4C4，即MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L。以MS為基本培養基，誘導圓珠半夏帶頂芽塊莖頂芽萌發和叢生芽形成時，生長調節劑最優水平組合為A4B4C3，即MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L。半夏生產上多采用小塊莖、珠芽等方法進行繁殖，但多代無性繁殖易受病毒侵染，而導致產量和品質下降[8-9]。試驗以半夏帶頂芽塊莖為材料，對半夏組培快繁體進行研究，為半夏塊莖組培苗生產提供理論依據和技術支持。