基于納米金-羅丹明B體系熒光增強檢測阿米卡星

王 睿，田 銳，劉航航，張美琪，何思媛

(延安大學 化學與化工學院；延安市分析技術與檢測重點實驗室，陜西 延安 716000)

阿米卡星(Amikacin)，是一種氨基糖苷類抗生素，在臨床上主要用于治療多種耐藥菌感染，由于阿米卡星有一定毒副作用，因此對其用量要有嚴格的控制，采取合適的方法對其進行檢測也尤為重要[1]。由于阿米卡星自身無特征紫外吸收，所以不能直接采用傳統HPLC(紫外)進行檢測，《中國藥典》2010年版二部[2]規定采用HPLC-柱前衍生化法對其進行檢測。文獻報道測定阿米卡星的方法有：旋光法、液相色譜-質譜法、光度法、電化學法、化學發光分析法、熒光法等[3-8]。熒光分析法由于儀器設備簡單、測定靈敏度高而在分析檢測中備受關注，但文獻報道的熒光分析法存在熒光探針制備復雜、絡合物穩定性差等問題，因此，發展新的簡單穩定的熒光分析法具有重要意義。

金納米粒子(納米金，AuNPs)具有獨特的光學性質，當納米金與熒光物質作用時，會由于彼此間距離及納米金尺寸的不同產生不同的熒光猝滅效應[9]，基于納米金與熒光物質的這一作用，納米金-熒光染料體系被廣泛應用于基因、藥物等的分析檢測[10，11]。本文基于分散態納米金對羅丹明B的熒光猝滅作用強于聚集態納米金及阿米卡星對納米金的誘導聚集作用，通過向納米金-羅丹明B(AuNPs-RhB)體系中加入阿米卡星使納米金聚集體系熒光信號增強，建立了基于AuNPs-RhB體系熒光增強測定阿米卡星的熒光分析新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2700型熒光分光光度計(日本日立公司)，TU1901紫外-可見分光光度計(普析光學儀器有限公司)。

氯金酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，檸檬酸三鈉、羅丹明B(分析純，西安化學試劑廠)，阿米卡星(標準品，中國藥品生物制品檢定所，0904031105)，其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 AuNPs的制備

AuNPs按文獻方法制備[12]︰取50.00 mL 1.0 mmol/L的氯金酸于圓底燒瓶之中，加熱至回流后快速加入5.00 mL 38.8 mmol/L的檸檬酸鈉，繼續回流15 min后去掉加熱器，冷卻過濾后置于棕色瓶于冰箱中4℃存放備用。

1.3 實驗方法

取1.00 mL RhB(1.0×10-5mol/L)和1.00 mL AuNPs置于比色管內，將其搖勻，靜置作用15 min后稀釋定容至10 mL，得AuNPs-RhB測試液。取2.00 mL AuNPs-RhB測試液于10 mL比色管中，加入阿米卡星靜置反應15 min后用超純水定容至5 mL，測定其熒光強度(對照組熒光信號值記為F0，樣品組熒光信號值記為F)，根據阿米卡星濃度與兩者熒光信號差值ΔF(ΔF=F-F0)的關系對阿米卡星含量進行測定。

2 結果與討論

2.1 阿米卡星與AuNPs-RhB體系作用的光譜研究

a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.AuNPs-阿米卡星;d.AuNPs-RhB-阿米卡星;e.RhB;f.RhB-阿米卡星;g.阿米卡星

圖1吸收光譜

檸檬酸鈉還原法制備的AuNPs帶負電荷，通過靜電排斥作用穩定分散[12]，RhB通過靜電作用吸附在AuNPs表面，然后經過分子碰撞與能量轉移使其熒光猝滅。當AuNPs發生聚集時，由于尺寸變大使得其對RhB的熒光猝滅程度減弱[13]，阿米卡星可與AuNPs作用使其發生聚集，從而使其對RhB的熒光猝滅作用減弱，體系熒光信號增強。為了驗證這一實驗原理，實驗分別對AuNPs、RhB、阿米卡星、AuNPs-RhB、AuNPs-阿米卡星、RhB-阿米卡星和AuNPs-RhB-阿米卡星進行了光譜掃描，結果如圖1所示。比較圖中曲線a、b、c發現，向AuNPs中加入RhB后其吸收光譜在600 nm之后沒有出現新峰，表明RhB不會與AuNPs作用使其發生聚集，而曲線c在600-750 nm出現的新峰正是聚集態納米金的吸收峰，表明阿米卡星引起了AuNPs的聚集。曲線d(AuNPs-RhB-阿米卡星)中520 nm、570 nm及650 nm附近的吸收峰分別為單分散態納米金、羅丹明B和團聚態納米金，比較曲線c、d、e、f可發現羅丹明B與阿米卡星和納米金都沒有發生相互作用或化學反應，證明在AuNPs-RhB-阿米卡星體系中是阿米卡星與納米金發生作用使其發生聚集。

實驗同時對RhB、AuNPs-RhB及AuNPs-RhB-阿米卡星進行了熒光光譜掃描，結果如圖2所示。圖中曲線的峰形和最大發射波長一致，對比曲線a、c發現納米金對羅丹明B有很強的熒光猝滅作用，比較曲線b、c則可發現加入了阿米卡星之后，體系的熒光明顯有所恢復，這是因為加入了阿米卡星之后，引起了AuNPs的聚集，而聚集態的AuNPs對RhB的熒光猝滅作用不如單分散態AuNPs強。

a.RhB b.AuNPs-RhB-阿米卡星 c.AuNPs-RhB

圖2熒光光譜

2.2 實驗條件的選擇

2.2.1 AuNPs與RhB的濃度和作用時間的選擇

固定羅丹明B(1.0×10-5mol/L)為1.00 mL，分別加入0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.00、1.50和2.00 mL的AuNPs溶液，加超純水定容至10 mL測定其熒光(圖3)。結果顯示隨著AuNPs加入量的增加ΔF持續增大，加入1.00 mL AuNPs后ΔF增加趨緩，考慮到過量的納米金會影響測定靈敏度，所以實驗選擇AuNPs與RhB的用量為體積比1∶1。

圖3 AuNPs用量對體系熒光強度的影響

將AuNPs與RhB按體積比1∶1混合后放置不同時間，考察二者作用時間對熒光測定的影響，實驗發現15 min后體系ΔF穩定。故確定羅丹明B(1.0×10-5mol/L)與AuNPs按體積比1∶1混合放置15 min得到穩定的AuNPs-RhB溶液。

2.2.2 AuNPs-RhB體系與阿米卡星作用時間的選擇

向AuNPs-RhB溶液中加入阿米卡星，反應不同時間后進行測定，結果顯示(圖4)加入阿米卡星的前10 min體系ΔF持續增加，之后趨于平穩，這應該是10 min后體系中兩種形態AuNPs達到平衡，為了保證體系的穩定性實驗選擇反應時間為15 min。

圖4 AuNPs-RhB體系與阿米卡星反應時間對體系熒光的影響

2.2.3 反應溫度的選擇

將AuNPs-RhB溶液置于不同溫度下，分別加入阿米卡星作用15 min后測定其熒光，實驗發現隨著溫度升高體系ΔF持續降低(圖5)，實驗選擇在室溫(24℃)下進行測定。

圖5 溫度對體系熒光的影響

2.3 標準曲線與檢出限

優化實驗條件下，采用本方法對阿米卡星進行了測定，結果表明，在7.80×10-6～1.25×10-4mol/L濃度范圍內體系的ΔF值與阿米卡星濃度呈良好的線性關系(如圖6所示)，線性方程為ΔF=5.5×104c(mol/L)+60.1，相關系數r=0.997，檢出限(S/N=3)為2.2×10-6mol/L。對1.0×10-5mol/L的硫酸阿米卡星標準溶液平行測定11次，其相對標準偏差(RSD)為2.7%。

a.7.80×10-6；b.3.00×10-5；c.5.00×10-5； d.7.00×10-5；e.1.00×10-4；f.1.25×10-4

圖6標準曲線

2.4 干擾試驗

在優化的實驗條件下，考察了可能存在的常見干擾對阿米卡星測定的影響。當阿米卡星的濃度為1.0×10-5mol/L時(相對誤差為±5%)，2000倍的生理鹽水，1000倍的葡萄糖，800倍的Zn2+、Al3+、Mg2+、Ca2+、D-果糖，不干擾測定。

2.5 樣品測定

取兩支不同廠家的硫酸阿米卡星注射液，用超純水稀釋后按實驗方法進行測定。測定結果表明，測定值與標識值基本一致。采用標準加入法測的樣品回收率在97.2%～98.5%之間，表明該方法用于針劑中阿米卡星含量的測定結果準確。

表1 硫酸阿米卡星針劑中阿米卡星含量測定結果(n=5)

注：1.宜昌人福藥業有限責任公司(批準文號H42021992)；2.成都通德藥業有限公司(批準文號H51021294)。

3 結論

在AuNPs-RhB的混合體系中，AuNPs通過熒光共振能量轉移使RhB的熒光猝滅，體系呈現弱熒光，阿米卡星的加入可使AuNPs產生聚集，由于聚集態AuNPs對RhB的熒光猝滅作用較弱，所以AuNPs-RhB體系的熒光有所增強，且增強程度在一定范圍內與阿米卡星濃度成正比，據此確立了測定阿米卡星的熒光分析新方法。該方法對針劑中阿米卡星的測定結果令人滿意，也有望用于人體用藥后體液中阿米卡星的測定。