提高大學生科學探究實踐的案例設計與分析
——《以革蘭氏染色方法及機理》為例

鄧振山，趙瑞華，賀曉龍，劉月芹

(延安大學 生命科學學院，陜西 延安 716000)

促進學生自主創新能力的培養，全面推進人才培養模式的綜合改革，尤其是培養學生的自學能力和創新精神已成為目前我國高等教育改革的核心問題[1]。微生物學是生物科學專業的一門重要的專業基礎課程，同時它也是實踐性很強的一門學科，在高等院校的生物科學、生物技術和生物工程及農、林、醫、環境等專業的教學計劃中占有很重要的地位。微生物學的知識和技能在當今社會的諸多領域中的應用十分廣泛，因此，高水平學校的微生物教學體系對于培養和提高學生的探究能力、創新精神和整體素質具有十分重要的意義[2]。鑒于此，本文以課堂教學案例的形式闡釋在本科課堂教學過程中如何培養學生的探究能力和創新意識，旨在倡導教師在平時的教學過程中有意識地注重大學生探究能力和科學思維能力的培養。在講授時，按照科學探究的方法，引導學生通過采用分組討論方式，完成探究過程。具體過程為：(1)觀察現象，提出問題(什么？為什么？如何？)；(2)提出科學假說(以解釋所觀察到現象內部深藏的機理和內在規律)；(3)設計科學實驗方案，驗證科學假設是否成立；(4)最后形成理論，并修改完善假說。

1 觀察現象，提出問題

革蘭氏染色(Gram Staining)是用來鑒別細菌的一種方法：這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學性質不同，可將細菌分成兩類，即革蘭氏陽性(Gram Positive)與革蘭氏陰性(Gram Negative)。革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，這種染色法是由一位丹麥醫生漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans Christian Gram，1853年-1938年)于1884年所發明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關系。后推廣為鑒別細菌種類的重要特性之一，對由細菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。

給學生強調革蘭氏染色法是其可將所有細菌染色的重要方法。其染色要點：先用結晶紫染液染色，再加媒染劑—碘液處理，使菌體著色，然后用乙醇脫色，最后用復染液(沙黃或番紅)復染。顯微鏡下菌體呈紅色者為革蘭氏染色陰性細菌(常以G-表示)深紫色者為革蘭氏染色陽性反應細菌(常以G+表示)。

具體通過G+菌(金黃色葡萄球菌)與G-菌(大腸桿菌)為例介紹染色的具體步驟及結果，創設情境讓學生首先從感官上先感受G+菌與G-菌染色的結果的差異，展示的效果見圖1和表1。

圖1 革蘭氏染色法的步驟及結果圖

步驟方法結 果陽性(G+)陰性(G-)初染結晶紫30 s紫色紫色媒染劑碘液30 s仍為紫色仍為紫色脫色95%乙醇10～20 s保持紫色脫去紫色復染蕃紅(或復紅)30～60 s仍顯紫色紅色

在此基礎上，啟發學生去思考所有的細菌經過革蘭氏染色，為什么能被染成兩種不同顏色？其內在的原因和機理是什么？還要給學生強調，此答案是在革蘭氏染色法發明后的一百多年，經過幾代科學家的不懈努力才找到其染色原因及機理，以此來激勵學生在科學的道路上，要不斷的堅持和探索，最終才能找到科學的真諦。

2 提出科學假說

繼續引導學生去思考和探究，學生可以利用空余時間自由組合成討論小組，結合自己對提出問題的理解，有針對性的開展自主查閱與問題內容有關的文獻，提出相應的科學假說，如：之所以出現兩種不同的染色結果可能存在外在因素和內在因素影響所致。具體的是(1)認為是外在因素影響，即由于不同的染色步驟反應的差別引起的，同學們就提出同一株菌株如果改變染色步驟或染色時間會染成不同顏色的假說；(2)認為是內在因素影響的，卻提出染色結果的差異是由于兩類細菌的細胞外膜結構的差異所致的假說。

3 設計科學實驗方案

學生依據各自提出的假說，撰寫實驗實施方案，自己動手做實驗進行驗證所提出的假說是否科學。在實驗過程中，要求學生認真做好實驗記錄，并對數據進行整理和分析。如認為是內在因素影響的，也就是說染色結果的差異是由于兩類細菌的細胞外膜結構的差異所致的同學，要想搞清其染色機理，首先必須要闡釋G+菌與G-菌細胞壁的化學組成結構差異所在。為此，該組學生去思考并找出革蘭氏陽性細菌(Gram positive)和革蘭氏陰性細菌(Gram negative)細胞壁的化學組成與超微結構的差異所在：

(1)革蘭氏陽性細菌

革蘭氏陽性細菌細胞壁具有較厚(30～40 nm)而致密的肽聚糖層，多達20層，占細胞壁的成分60%～90%，它同細胞膜的外層緊密相連(見圖2)。有的革蘭氏陽性細菌細胞壁中含有磷壁酸(teichoi-acid)，也即胞壁質(murein)。

圖2 革蘭氏陽性菌細胞壁結構圖

(2)革蘭氏陰性細菌

革蘭氏陰性細菌特殊的是外膜上含有許多獨特的結構(見圖示3)，如把外膜與肽聚糖層連接起來的布朗(Braun′s)脂蛋白，使營養物被動運輸通過膜的膜孔蛋白和起保護細胞作用的脂多糖(LPS)。脂多糖也稱為內毒素，對哺乳動物有高度毒性。

圖3 革蘭氏陰性菌細胞壁結構圖

G-細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，此外還有磷脂、多糖、和蛋白質。外膜被分為脂多糖層(外)、磷脂層(中)、脂蛋白層(內)。

1)肽聚糖層：G-細菌細胞壁肽聚糖層很薄，約有2～3 nm厚。它與外膜的脂蛋白層相連。

2)周質空間：周質空間(periplasmic space，即壁膜間隙)是革蘭氏陰性細菌細胞膜與外膜兩膜之間的一個透明的區域(見圖2)。它含有與營養物運輸和營養物進入有關的蛋白質，有：營養物進入細胞的蛋白；營養物運輸的酶，如蛋白水解酶；細胞防御有毒化合物，如破壞青霉素的-內酰胺酶。革蘭氏陽性細菌以上這些酶常分泌到胞外周圍，革蘭氏陰性細菌則依靠它的外膜，保持這些酶與菌的緊密結合。因此，在此基礎上，通過查閱相關文獻和小組討論，依據革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌細胞壁結構的差異，設計出通過改造革蘭氏陰性細菌細胞壁結構的方法，即通過加入十二級磺酸鈉(SDS)等表面活性劑以去除革蘭氏陰性細菌細胞壁最外層脂多糖，高速離心，取細胞體進行革蘭氏染色，看結果有無變化，從染色結果的變化推斷出染色的差異是由于兩種菌株的細胞壁結構差異所致的結論。

4 修改完善假說

最后學生經過探究和思考，并討論最終獲得革蘭氏染色機理如下：固定過的細胞經過初染，例如結晶紫染色，接著加碘液媒染，細菌細胞壁內由于染色形成結晶紫與碘的復合物。隨后加酒精從薄的細胞壁中洗出結晶紫與碘暗染色的復合物，但是結晶紫—碘復合物不能從厚的細胞壁中洗出。最后，用較淺的石炭酸復紅復染。加石炭酸復紅染色，使脫色的細胞呈粉紅色，但在含厚的肽聚糖暗染色的細胞中沒有看到粉紅色，仍保持第一次的染色結果。保持原來染色(厚的細胞壁)的細胞稱作革蘭氏陽性，在光學顯微鏡下呈現藍紫色。脫色的細胞(薄的細胞壁和外膜)稱作革蘭氏陰性，染成粉紅色。

5 結語

通過這樣的探究過程，使學生明白科學的探究全過程，依靠自己去思考、去探究、去驗證想法，這極大地激發了學生們的創造能力，也讓課堂更生動更有活力。從而，經過學生的積極思考和主動參與，在教師主導作用下，潛默移化地培養了學生科學探究能力，激發了創新意識。還可以激發學生對科學研究的積極性，在本科學習中營造濃厚的學術氛圍，充分調動學生認知客觀世界的能力，同時將教學和科研緊密結合。

經過科學探究能力的培養，近2年來“陜北地區原油污染土壤的微生物修復技術”等30多個項目先后獲得國家級“大學生創新創業訓練計劃”計劃項目的立項，本科生畢業發表的微生物學相關的學術論文20余篇，并2次獲得全國大學生互聯網+大賽省級銀獎和銅獎。同時，通過科學探究意識的訓練和創新實踐能力的培養，真正使個人科學素養培養落到實處，并使學生終身受益。讓學生在鞏固理論知識的同時，培養了學生科研創新思維能力。

因此，通過教學實踐模式表明，將科學探究過程融入到基礎微生物學教學過程的目的是激發學生科學研究和探索的積極性和主動性，使其更好地掌握微生物學基本理論，并培養學生科學思維能力。