直腸癌組織中HIF-1α和Survivin的表達及對新輔助放化療后腫瘤退縮的預測價值

司志龍，李運奇，胡波，桂華偉，肖飛

目前，術前新輔助放化療聯合全直腸系膜切除術（TME）已成為局部進展期直腸癌患者治療的金標準。新輔助放化療的優點在于縮小腫瘤、降低分期、提高手術切除率或保肛率。但新輔助放化療后仍有一部分分化差的腫瘤因其本身對放化療并不敏感，術前治療只是延誤了手術時間，放化療期間腫瘤仍在進展［1］。因此，尋找對新輔助治療效果有預測價值的生物標志物是直腸癌新輔助治療領域迫切需要解決的問題之一。有研究顯示，缺氧誘導因子（HIF）-1α［2］和凋亡抑制蛋白生存素（Survivin）［3-4］可以通過多種途徑降低結直腸癌對放化療的敏感性。本研究旨在探討HIF-1α、Survivin 在直腸癌組織中的表達及對直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮效果的預測價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析我院2014 年4 月—2018 年8 月收治的直腸癌患者83例，所有患者術前均行新輔助放化療，治療結束后行TME。納入標準：（1）術前病理證實為腺癌，腫瘤距肛門＜12 cm。（2）根據2017年第8版美國癌癥聯合委員會（AJCC）結直腸癌TNM分期系統，分期屬于Ⅱ～Ⅲ期。（3）通過查詢患者歷次住院資料可以獲得完整的臨床病理信息。（4）患者及家屬知情同意。排除標準：（1）術前接受免疫治療和（或）分子靶向治療。（2）合并其他惡性腫瘤。83例中男51例，女32 例，年齡36～81 歲，平均年齡（62.8±9.2）歲。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2 新輔助放化療及手術方案 新輔助放化療中，患者接受總劑量50.0 Gy 的長程放療，每周5 次，每次2.0 Gy，共25 次；在長程放療期間同步進行化療，化療方案選用卡培他濱單藥或持續灌注5-氟尿嘧啶（5-FU）或5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣（5-FU/LV），治療結束后均于6～10周內行TME治療，手術方式包括低位前切除術（LAR）、腹會陰聯合直腸切除術（APR）和經括約肌間切除術（ISR），所有患者均為R0切除。

1.3 腫瘤退縮評價 參考美國癌癥聯合委員會評分系統（AJCC-TRG），依據腫瘤退縮分級評分進行評價。0級（完全退縮）：無腫瘤細胞殘留；1級（中等退縮）：單個或者小灶腫瘤細胞殘留；2級（輕微退縮）：腫瘤殘留、間質見大量纖維化；3級（無退縮）：廣泛腫瘤殘留、無或少量腫瘤細胞壞死。0～1級定義為退縮有效，2～3級定義為退縮無效。

1.4 免疫組化及結果判定 收集本研究組患者的術前活檢標本，檢測標本中HIF-1α 和Survivin 的表達。鼠抗人HIF-1α抗體購自武漢博士德公司，兔抗人Survivin 抗體購自美國Santa Cruz 公司，其余所用試劑購自北京中杉金橋生物有限公司。采用免疫組化SP 法，參照試劑盒說明檢測兩者的表達。染色結果判定由病理科?？漆t生獨立閱片，根據腫瘤細胞染色的陽性強度和陽性細胞的占比進行綜合評定。染色強度計分：染色與陰性對照相同者計0分，染色呈淡黃色者計1 分，棕黃色者計2 分，褐色者計3 分；陽性范圍計分：0%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，76%～100%計4分。將上述兩項計分相加分級，1～2分為（-），3分為（±），4～5分為（+），6～7分為（++），定義≥4分為陽性表達，＜4分為陰性表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學分析，計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗，相關性采用Spearman等級相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤退縮情況及手術標本的病理改變 直腸癌新輔助治療后，腫瘤退縮總有效率為55.4%（46/83），完全退縮者13 例，中等退縮者33 例，輕微退縮者20 例，無退縮者17 例，完全緩解者的大體標本如圖1A 箭頭所示，可見腫瘤完全退縮形成瘢痕，鏡下可見纖維組織增生、大量炎癥細胞浸潤，見圖1B。

Fig.1 Gross specimen and microscopic appearance of completely alleviated patients(HE staining,×400)圖1 完全緩解者的大體標本和鏡下所見（HE染色，×400）

2.2 直腸癌組織中HIF-1α 和Survivin 的表達情況 HIF-1α 和Survivin 在直腸癌組織中均呈高表達，陽性表達率分別是61.4%（51/83）、67.5%（56/83），HIF-1α 表現為程度不等的細胞質染色，Survivin 為細胞核染色，呈黃色或褐色顆粒，見圖2。Spearman 等級相關檢驗顯示直腸癌組織中HIF-1α和Survivin 的表達呈正相關（rs=0.587，P＜0.01），見表1。

Fig.2 Positive expressions of HIF-1α and Survivin in rectal cancer tissues(SP,×200)圖2 直腸癌組織中HIF-1α和Survivin的陽性表達（SP，×200）

2.3 HIF-1α 和Survivin 的表達與臨床病理特征的關系 根據患者治療前的影像學檢查進行臨床分期，不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移狀態分組患者HIF-1α、Survivin 陽性表達率差異有統計學意義（P＜0.05），不同年齡、性別、腫瘤浸潤深度分組，患者HIF-1α、Survivin 陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.1 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin表1 HIF-1α和Survivin表達的關系

Tab.2 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin and clinicopathologic features表2 HIF-1α和Survivin的表達與臨床病理特征的關系

2.4 HIF-1α 和Survivin 的表達與新輔助放化療后腫瘤退縮效果之間的關系 HIF-1α 陽性表達者腫瘤退縮有效率低于陰性表達者，Survivin陽性表達者腫瘤退縮有效率顯著低于陰性表達者（均P＜0.05），見表3。

2.5 HIF-1α 和Survivin 的聯合表達與新輔助放化療后腫瘤退縮之間的關系 根據直腸癌組織中HIF-1α 和Survivin 的表達情況，將上述患者分為4組，4 組患者中腫瘤退縮有效率差異有統計學意義（P＜0.05），其中，HIF-1α 和Survivin 同時陽性者放化療有效率明顯低于其他組別，見表4。

3 討論

新輔助放化療是局部進展期直腸癌治療的標準方式，但仍有部分患者的治療效果不夠理想。近年來，腫瘤分子標志物在放化療中的預測價值成為研究熱點，但直腸癌新輔助放化療分子靶標的報道并不多，對治療效果的預測價值也不確切。如果能在新輔助放化療前通過檢測某些生物標志物篩選出對其應答不敏感的患者，可避免不必要的術前治療。

Tab.3 Relationship between expressions of HIF-1α and Survivin and tumor regression after neoadjuvant chemoradiotherapy表3 HIF-1α和Survivin的表達與新輔助放化療后腫瘤退縮效果之間的關系

Tab.4 Relationship between combined expressions of HIF-1α and Survivin and tumor regression after neoadjuvant chemoradiotherapy表4 HIF-1α和Survivin的聯合表達與新輔助放化療后腫瘤退縮之間的關系

有研究表明，HIF-1α 參與腫瘤多種信號通路，調控腫瘤血管生成、控制細胞增殖和能量代謝、抑制腫瘤細胞凋亡，為放療下存在的乏氧腫瘤細胞提供能量，從而降低了腫瘤細胞的放療敏感性［5-7］。最新的研究顯示，HIF-1α的表達上調可以降低結直腸癌對放療的敏感性［2］，促進結直腸癌的進展和轉移［8-9］。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族的成員，是目前為止作用最強的凋亡抑制分子，在幾乎所有腫瘤組織中高表達，參與腫瘤細胞DNA修復、增殖、自噬、凋亡等多個過程［10］，還參與了腫瘤的多藥耐藥過程，是腫瘤耐藥的一個重要調節因子。最近的研究顯示，Survivin表達上調降低了結直腸癌細胞對放化療的敏感性［3-4］，Survivin 可能參與了結直腸癌中腫瘤的進展［11］，并能夠促進其浸潤和轉移［12］。但是，對于直腸癌中HIF-1α和Survivin的聯合檢測以及兩者對直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮的預測價值少有報道。

本研究選取行新輔助放化療的局部進展期直腸癌患者的術前活檢組織，重新檢測組織中HIF-1α和Survivin的表達，并結合其臨床病理資料進行了回顧性分析，初步探討兩者對局部進展期直腸癌新輔助放化療后腫瘤退縮效果的預測價值。本研究顯示不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移狀態患者，HIF-1α 陽性表達差異有統計學意義，與Novell 等［13］的研究結果一致；Survivin 陽性表達在不同腫瘤分化程度、淋巴結轉移狀態患者，差異有統計學意義，與Wang等［14］的研究結果一致。同時發現HIF-1α（+）/Survivin（+）組的腫瘤退縮有效率明顯低于其他組別，提示兩者的表達狀態對腫瘤的退縮有不同影響，本研究同時發現HIF-1α和Survivin的表達呈明顯的正相關，推測HIF-1α 直接誘導或者間接影響Survivin在直腸癌中的表達，且兩者在腫瘤抗凋亡過程中具有協同作用。有研究表明，HIF-1α可以誘導信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）信號上游分子白介素-6 的表達，從而活化STAT3 通路［15］。STAT3信號通路的持續激活又可以通過調節下游相關靶基因的表達，主要包括血管內皮生長因子（VEGF）、Survivin、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）、c-Myc、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、細胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）、髓樣細胞白血病-1（Mcl-1）等，促進血管生成、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、促進腫瘤侵襲和轉移［16］。鑒于此，推測Survivin 的上游激活區有HIF-1α 的結合位點，即HIF-1α 可能通過STAT3 上調Survivin 的表達，促成了兩者在直腸癌抗凋亡過程中的協同作用，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。

HIF-1α和Survivin的表達情況對進展期直腸癌新輔助治療后腫瘤退縮的效果預測提供了一定的臨床證據，通過靶點HIF-1α 和Survivin 可能會是增強直腸癌新輔助放化療有效性的抗腫瘤策略，但鑒于本研究為回顧性研究以及選取的病例數量有限，更明確的預測價值需要多中心、大樣本的研究來證實。同時，由于腫瘤的增殖與凋亡、對放療的敏感性和對化療藥物的耐藥性、侵襲與轉移等是一個極其復雜的過程，不可能僅限于一兩個細胞因子，更不會只取決于某條信號通路，所以還有很多問題尚待解決。