多指標綜合評定肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛的譜效關系

肖俊勇，李力，從仁懷，劉宏

(1.華中科技大學無限極現代制劑技術聯合實驗室，武漢 430075；2.武漢藥明康德新藥開發有限公司，武漢 430075；3.國家納米藥物工程技術研究中心，武漢 430075)

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥種仁[1]，又稱肉果、玉果，俗稱肉蔻。主要產地有馬來西亞、印度尼西亞等，我國海南、云南、廣東等地亦有栽培，但因氣候不適以及收益期長，國內市場肉豆蔻主要源于進口[2-3]。肉豆蔻種仁入藥，可治虛瀉冷痢、脘腹冷痛、嘔吐、抗炎鎮痛、抑菌、抗抑郁、抗癌以及降血糖血脂等[4]，外用可作寄生蟲驅除劑，治療風濕痛等。肉豆蔻主要活性成分為揮發油[5]，其揮發油中化學成分主要是單萜類和芳香類化合物。

中藥譜效學是在中醫藥理論現代研究的基礎上，以中藥指紋圖譜為基礎，以效應及效應體學為主要內容，應用生物信息學方法，建立中藥指紋圖譜與中藥質量療效內在關系的一門學科[6]。中藥成分復雜，對疾病的治療往往是多種成分通過多靶點和多環節發揮整體作用，單一藥效指標難以全面反映中藥的藥效信息[7]。因此，隨著中藥譜效學研究的逐漸深入，新的中藥多維譜效關系研究方法和模式逐漸形成，即選擇先進的分析手段對化學成分進行多維分析以及盡可能多的選擇與療效密切相關的多種藥效指標探討譜效關系。目前筆者尚未見肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛譜效關系的報道，因此，筆者運用灰色關聯度分析法對肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛的譜效關系進行研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SPF級Wistar大鼠132只，體質量150～200 g，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，合格證編號No.42000600025917。

1.2材料 肉豆蔻揮發油(課題組前期提取分離獲得的19個揮發油，S1-S19)，雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS，Aladdin公司，含量≥99%，批號：K1702042)；無水乙醇(含量≥99.7%，批號：20160928)，二甲苯(含量≥99.0%，批號：20160929)，包埋石蠟(批號：20170303)，中性樹膠(批號：88000109)購于國藥集團化學試劑有限公司；完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，鏈霉親和素-生物素復合物(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫組織化學試劑盒，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒，環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抗體，均購于武漢博士德生物工程有限公司；神經激肽-1受體(neurokinin-1 receptor ，NK-1R)抗體(Millipore公司)；大鼠P物質酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Abbkine公司)。

1.3儀器 7890A-5975C型氣質聯用儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)(美國安捷倫科技有限公司)，HP-5MS氣相毛細管柱(美國安捷倫科技有限公司)，ZH-200熱刺痛儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)，ZH-ZZY足趾容積測量儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)，C2500-R-230V微型高速離心機(美國Labnet)，ICV-450電熱恒溫培養箱(日本ASONE)，Multiskan MK3全自動酶標儀(Thermo scientific)，RM2016病理切片機(德國Leica)，JK-6組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司)，BX53顯微鏡[成貫儀器(上海)有限公司]。

1.4GC-MS檢測方法 采用頂空進樣方法：稱取肉豆蔻揮發油0.5 g，置于10 mL專用頂空瓶中，采用CTC PAL自動進樣器，80 ℃平衡15 min；GC條件：HP-5MS石英毛細管柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，載氣：氦氣，載氣流速1 mL·min-1，進樣量500 μL，分流比50：1。采用程序升溫：初始溫度40 ℃(保持2 min)，6 ℃·min-1升溫速率升至240 ℃(保持2 min)；質譜(MS)條件：離子源EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，倍增管電壓：1.2 kV，接口溫度280 ℃，質量范圍50～550。

1.5肉豆蔻揮發油指紋圖譜的建立及相似度分析 將19個肉豆蔻揮發油樣品的GC-MS檢測結果采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)進行分析。

1.6藥效實驗

1.6.1慢性炎性疼痛模型的建立 于Wistar大鼠右后肢足底中部皮下注射完全弗氏佐劑0.15 mL，建立慢性炎性疼痛模型。

1.6.2動物分組及給藥 取大鼠132只，隨機分成22組，每組6只，適應性喂養1周，分別為空白對照組(于大鼠右后肢足底中部皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.15 mL)、模型對照組、雙氯芬酸鈉組(雙氯芬酸鈉2.5 mg·kg-1)、模型+肉豆蔻揮發油組(19組，30 mg·kg-1)。空白對照組及模型對照組每天灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，雙氯芬酸鈉組每天灌胃給予相應劑量的雙氯芬酸鈉，肉豆蔻揮發油組每天灌胃給予相應劑量的肉豆蔻揮發油。

1.6.3足趾腫脹程度 分別于第0，1，3，5，7，14，21，28天用足趾容積測量儀測定大鼠造模腳(右腳)腳掌的腫脹程度。

1.6.4輻射熱痛覺閾值 分別于第0，1，3，5，7，14，21，28天用熱刺痛儀測定大鼠造模腳(右腳)的輻射熱痛覺閾值。

1.6.5NK-1R、COX-2檢測 動物造模、分組及給藥同“1.6.1”和“1.6.2”項，于第4周進行樣本采集。解剖大鼠，取第 5 腰椎背根神經節，10%中性甲醛室溫固定，制備石蠟切片。按SABC法免疫組織化學染色操作步驟進行 NK-1R、COX-2 的免疫組織化學染色，鏡檢，測定NK-1R、COX-2。

1.6.6P物質檢測 動物造模、分組及給藥同“1.6.1”和“1.6.2”項，于第4周進行樣本采集。頸部取血，靜置，離心(3500 r·min-1，5 min)，取上清液，-80 ℃保存，采用ELISA法檢測血液中 P 物質含量。

1.7灰色關聯度分析法分析譜效關系 根據灰色關聯度算法，本文以19個肉豆蔻揮發油的26個共有特征峰作為比較數列(子序列)，構成26個子序列記為[Xi(k)]，以肉豆蔻揮發油樣品藥效學指標足趾腫脹程度、輻射熱痛覺閾值、P物質、NK-1R和COX-2作為參考序列(母序列)記為[X0(k)]，計算[X0(k)]與[Xi(k)]的關聯度并排序。

2 結果

2.1肉豆蔻揮發油指紋圖譜的建立及相似度分析結果 分析得對照指紋圖譜見圖1，19個肉豆蔻揮發油指紋圖譜見圖2，相似度結果見表1，各特征共有峰的面積見表2。根據表1結果發現各樣品之間兩兩比較相似度為0.008～0.999，其中S5、S6、S14和S18這4個樣品與其他樣品比較差異有統計學意義，相似度均小于0.700。19種肉豆蔻揮發油之間存在差異，可作為譜效分析的樣品。根據肉豆蔻揮發油指紋圖譜分析得26個特征共有峰，由表2可知，其峰面積之和均占各樣品總峰面積的87.00%～99.98%，可較好代表該樣品。

圖1 肉豆蔻揮發油的對照指紋圖譜

圖2 肉豆蔻揮發油指紋圖譜

表1 不同肉豆蔻揮發油相似度評價結果

表2 GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積

續表2 GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積

2.2足趾腫脹程度測量結果 大鼠造模腳(右腳)的腫脹程度結果見表3。由表3可知：右腳變化較為明顯，與空白對照組比較，給藥后第1天給予完全弗氏佐劑的大鼠均有明顯腫脹；給藥后第3天，模型對照組依然明顯腫脹，而各給藥組均有不同程度的緩解，其中S3、S4、S6、S7、S8、S15、S16和S19組消腫效果顯著，均優于雙氯芬酸鈉組；給藥后第5，7，14，21天模型對照組與各給藥組具有不同程度的緩解；給藥后第28天，各給藥組緩解程度均優于模型對照組，其中S3和S4組消腫效果最好，19個肉豆蔻揮發油給藥組中僅S2組消腫效果弱于雙氯芬酸鈉組，緩解程度順序為S3≈S4>S6≈S9≈S19>S1>S7≈S18>S17>S14≈S13>S12>S5>S10>S8≈S16≈S11=S15>雙氯芬酸鈉>S2。

2.3輻射熱痛覺閾值測量結果 大鼠造模腳(右腳)的熱痛覺閾值結果見表4。由表4可知，與空白對照組比較，給藥后第1天給予完全弗氏佐劑的大鼠的熱痛覺閾值均明顯降低；給藥后第3天，模型對照組和各給藥組的熱痛覺閾值均有不同程度的回升，各給藥組的回升程度均高于模型對照組，其中S5、S15、S18、S19和雙氯芬酸鈉組的熱痛覺閾值回升程度顯著。給藥后第14，21天，各給藥組熱痛覺閾值回升程度均高于模型對照組，其中S4組緩解疼痛的效果顯著。給藥后第28天，除S17、S18組外其他各給藥組熱痛覺閾值回升程度均高于模型對照組，其中S4組緩解疼痛效果最好，19個肉豆蔻揮發油給藥組中S1、S13、S19、S8、S9、S18和S17組緩解效果弱于雙氯芬酸鈉組，緩解順序為S4>S6>S15≈S11>S7>S14>S16>S2>S5>S3>S10>S12≈雙氯芬酸鈉>S1≈S13>S19>S8>S9>模型對照>S18>S17。

表3 大鼠右腳腫脹程度

表4 大鼠右腳熱痛覺閾值

2.4NK-1R、COX-2檢測 大鼠第五腰椎背根神經節通過免疫組織化學染色法檢測的NK-1R和COX-2的平均吸光度見表5。由表5可知，給藥后第4周，各給藥組間NK-1R和COX-2的表達量均出現不同程度的改變，通過比較分析可知，與空白對照組比較，模型對照組NK-1R表達量顯著升高；與模型對照組比較，各給藥組NK-1R表達量均有不同程度的降低，其中S5-S17組顯著降低(P<0.01)；各給藥組NK-1R表達量降低程度順序為S13>S11>S7>S10>S8>S9>S15>S17>S12>S16>S14>空白對照>S6>S5>S19>S18>S2>S3=S4>S1>模型對照>雙氯芬酸鈉，19個肉豆蔻揮發油給藥組NK-1R表達量降低程度均優于雙氯芬酸鈉組。與空白對照組比較，模型對照組COX-2表達量顯著升高；與模型對照組比較，各給藥組COX-2表達量均有不同程度的降低，其中S5、S7、S8、S12、S16和S17組顯著降低(P<0.01)；各給藥組COX-2表達量降低程度順序為S5>S7>S16>S8>S12>S17>S18>空白對照>S13>S11>S3>S15>S9>S10>S6>S2>S4>S14>雙氯芬酸鈉>S19>S1>模型對照，19個肉豆蔻揮發油給藥組中S19和S1組的COX-2表達量降低程度低于雙氯芬酸鈉組。

2.5P物質檢測結果 大鼠血液中P物質的釋放量結果見表5。由表5可知：給藥后第4周，各給藥組間P物質釋放量均出現不同程度的改變，通過比較分析可知各給藥組P物質釋放量降低程度順序為S6>S16>S14>S13>S19>S18>S12>S10>S11>S17>S8>DS>S15≈S2>S9>模型對照>S3>S4>S5>S1>S7，19個肉豆蔻揮發油給藥組中S15、S2、S9、S3、S4、S5、S1和S7組的P物質釋放量降低程度低于雙氯芬酸鈉組，S3、S4、S5、S1和S7的P物質釋放量高于模型對照組。

2.6灰色關聯度分析結果 關聯度匯總結果見表6，關聯序匯總結果見表7。由表6和表7可知，26個特征共有峰對各藥效評價指標和總藥效的關聯度均大于0.6，其中關聯度最高的前五位峰為6號峰>8號峰>9號峰>5號峰>12號峰，可見肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛效果是其有效物質成分群共同作用的結果。

表5 NK-1R和COX-2的平均吸光度和血液中P物質

3 討論

慢性炎性疼痛是全世界的重要健康問題之一，它嚴重影響著人們的生活質量，每年用于慢性炎性疼痛的治療費用很大程度加重公共醫療的經濟負擔[8-9]。因此，如何有效地緩解慢性炎性疼痛是亟需解決的問題。用于慢性炎性疼痛治療的藥物主要有苯二氮類藥物、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)拮抗劑、非甾體類抗炎藥物和阿片類藥物等[10-13]，這些藥物有一定的緩解慢性炎性疼痛效果，但因其副作用而應用受到限制。越來越多的研究發現中草藥是緩解和治療慢性炎性疼痛的有效途徑[14]，如肉豆蔻揮發油可通過抑制COX-2的表達和降低血液中P物質的釋放來緩解完全弗氏佐劑所致慢性炎性疼痛[15]。背根神經節作為痛覺傳導的初級神經元，近年來已成為疼痛治療的重要研究靶點[16]。炎性遞質COX-2、NK-1R和P物質等本身又是致痛物質，在炎癥反應和疼痛傳導過程中均產生重要作用。因此，本研究綜合足趾腫脹程度、輻射熱痛覺閾值、第五腰椎背根神經節中NK-1R、COX-2的表達以及血液中P物質的釋放這5個指標對肉豆蔻揮發油的藥效學進行評價。

表6 關聯度匯總結果

目前，用于中藥譜效學的分析方法主要有灰色關聯度分析法、回歸分析和相關分析等。采用灰色關聯度分析法對肉豆蔻揮發油GC-MS指紋圖譜和各藥效評價指標以及總藥效進行綜合分析，此分析方法對數據要求較低，可分析小樣本[17]。由于數列單位不同或量綱不同，在進行關聯分析之前，需要對各數列進行無量綱化處理。本研究釆用均值化法對數據進行標準化處理，可盡量避免兩端值的影響而造成的數據失真，降低無量綱化處理對結果的影響。

表4中第28天模型對照組與空白對照組和各給藥組比較，均差異無統計學意義。可能是因為環境溫度極低導致室溫達不到恒溫要求，從而影響大鼠腳底熱痛覺閾值。因此，后期實驗過程中應嚴格控制室溫恒溫。表5中各組之間P物質均差異無統計學意義，根據當時實驗條件分析，可能與大鼠處死時環境溫度過低，從而影響大鼠血液中P物質的釋放和分布有關。

表7 關聯序匯總結果

綜上所述，不同的肉豆蔻揮發油對足趾腫脹、熱痛、NK-1R表達、COX-2表達和P物質的釋放均有不同程度的緩解，大部分肉豆蔻揮發油樣品緩解慢性炎性疼痛的效果均優于模型對照組，說明肉豆蔻揮發油具有緩解慢性炎性疼痛的作用。肉豆蔻緩解慢性炎性疼痛作用是其有效物質成分群——26個特征共有峰代表的化學成分共同作用的結果，雖然各特征共有峰代表的化學成分與各藥效評價指標和總藥效的關聯度大小不同，但都是肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛的有效成分，其中與緩解慢性炎性疼痛關聯度最高的前五位峰為6號峰>8號峰>9號峰>5號峰>12號峰。本研究為以有效成分為基礎的中藥材質量控制標準的建立提供了參考依據，后期可對肉豆蔻揮發油緩解慢性炎性疼痛譜效關系深入研究，對其有效物質成分群中的成分進行進一步分析鑒定。