LC-MS/MS法測定人血漿中霉酚酸濃度及其在心臟移植患者藥動學研究中的應用*

趙曉亞，王藝茸，周紅，蔡杰，張菁，向紅平，張敏，韓勇

(1.武漢海關技術中心，武漢 430021；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥劑科，武漢 430022；3.重慶醫科大學藥學院，重慶 400016；4.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心血管外科，武漢 430022)

霉酚酸(mycophenolic acid, MPA)是一種新型的抗代謝免疫抑制藥，其通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)阻斷DNA的從頭合成，從而抑制T和B淋巴細胞增殖發揮作用[1-2]。目前，臨床常用的MPA制劑包括嗎替麥考酚酯(MMF，商品名：驍悉)和麥考酚鈉腸溶片(商品名：米芙)，它們常與他克莫司和糖皮質激素組成三聯免疫抑制治療方案，對預防器官移植術后急慢性排斥反應具有重要意義。近年來，臨床研究表明，MPA藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)與其臨床療效和不良反應發生密切相關[3-5]，但個體MPA-AUC存在較大差異，可通過治療藥物濃度監測(TDM)進行個體化劑量調整[6-7]。國內外已有眾多有關MPA在腎移植和肝移植患者體內藥動學研究及TDM報道[8-10]，但筆者尚未見在心臟移植患者中報道。為此，本文旨在參照生物樣本分析方法指導原則[11-12]，建立液相色譜-質譜串聯(LC-MS/MS)法檢測MPA，并將該方法學用于心臟移植患者術后MPA的藥動學研究，為臨床個體化用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1儀器 LC-20ADXR型高效液相色譜儀(日本島津公司)，API 6500型-三重四極桿質譜儀(美國AB SCIEX公司)，AB135-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)，5804R 低溫高速離心機(德國 Eppendorf公司)，Milli-Q 超純水系統(美國Millipore公司)。

1.2試劑 霉酚酸對照品(中國食品藥品檢定研究院, 含量>99%)，霉酚酸-d3內標(加拿大TRC公司，含量98%)，色譜級甲醇(美國Sigma公司，含量≥99.9%)，色譜級乙腈(美國Sigma公司，含量≥99.9%)，色譜級甲酸(德國CNW公司，含量≥98.0%)，色譜級乙酸銨(德國CNW公司，含量≥98.0%)。

1.3色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×50 mm, 3.5 μm)；流動相：5 mmol·L-1乙酸銨(含0.25%甲酸)溶液 (A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫：0～1 min，75%A；1～8 min，75%→5%A；>8～9 min，5%A；>9～9.5 min, 5%→75%A ；>9.5～15 min，75%A。流速0.2 mL·min-1；進樣體積：2 μL；柱溫：28 ℃。

1.4質譜條件 采用電噴霧離子化電離源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓：-4500 V；干燥溫度：350 ℃；離子源氣體 1 (N1)壓強：344.75 kPa；離子源氣體2 (N2)壓強：413.70 kPa；氣簾氣壓強：241.32 kPa。定量方式為多重反應監測 (MRM)；MPA的離子對、解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)分別為：m/z319.1→191.0、-100 V和-26 V；MPA-d3離子對、DP、CE分別為：m/z322.1→191.1、-60 V和-31 V。

1.5儲備液及工作液的配制 精密稱取MPA 20 mg、MPA-d3對照品1 mg分別置于10 mL棕色量瓶中，均以甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得2 mg·mL-1MPA儲備液,0.1 mg·mL-1MPA-d3儲備液，置于4 ℃避光保存。

1.6標準曲線血漿樣品及質控血漿樣品的制備 精密量取儲備液，加入一定量甲醇，配制一系列含有MPA(1, 5, 10, 50, 100, 200, 400 μg·mL-1)的標準曲線工作液及含有MPA(1.25, 75, 250 μg·mL-1)的質控工作液。取空白血漿200 μL，分別加入MPA標準曲線系列工作液和質控對照品工作液20 μL，混勻后得到標準曲線血漿樣品(0.1，1，5，10，20，40 μg·mL-1)及質控血漿樣品 (0.125, 7.5, 25 μg·mL-1)。

1.7樣品前處理 取血漿樣品200 μL，置于1.5 mL離心管，加入2 μg·mL-1內標溶液20 μL，加入乙腈800 μL，渦旋混合均勻，于4 ℃ ，以12 000×g。取上清液200 μL,加入乙腈800 μL后混勻，取200 μL加入2 mL進樣瓶。

1.8藥動學研究 將本文建立的MPA檢測方法應用于心臟移植患者MMF單次給藥后藥動學研究(分別于服藥前，服藥后0.5,1,1.5，2，4，6，8，10，12 h采血)以及維持治療達穩態后MPA谷濃度測定。本研究經華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院倫理委員會批準，采血前告知患者實驗目的并簽署知情同意書，EDTA 抗凝管采集靜脈血 2 mL，分離血漿后，按本研究的方法進行檢測。

采用Winnonlin軟件以非房室法計算MPA藥動學參數，如清除率(CL/F)、表觀分布容積(Vd)，峰濃度(Cmax)和達峰時間(tmax)均為實測值；根據末端相3-4點血藥濃度-時間數據估算消除速率常數(Ke)，進而計算消除半衰期(t1/2)；以梯形法估算AUC0-12和AUC0-∞。

2 結果

2.1方法專屬性 在本研究測定條件下，MPA、MPA-d3的保留時間分別為 5.94和5.93 min，空白血漿中的內源性物質不干擾MPA和內標的測定。典型色譜圖見圖1。

A.空白血漿；B.空白血漿+ MPA對照品；C.空白血漿+MPA-d3；D.心臟移植患者血漿樣本；1.MPA；2.MPA-d3。

2.2標準曲線與線性范圍 取MPA分別為 0.1, 1, 5, 10, 20, 40 μg·mL-1的標準曲線混合血漿樣品，按“1.7”項下方法進行操作，記錄色譜峰面積，以MPA與內標的峰面積比(Y)分別對血漿中二者的濃度進行加權線性回歸，權重系數為1/χ2[13]，求得二者標準曲線方程如下：Y=2.416 16X+0.013 96 (r=0.999 6)，共評價4條標準曲線，R2值均>0.995。4條標準曲線相應的校正標樣回算濃度與標示值的百分比均符合指導原則，表明MPA在 0.1～40 μg·mL-1線性良好。

2.3準確度與精密度 取定量下限(0.1 μg·mL-1)、低(0.125 μg·mL-1)、中(7.5 μg·mL-1)、高(25 μg·mL-1)共 4 個濃度血漿樣品，每一濃度每天平行測定5份，以計算準確度和日內精密度，連續測定3 d，獲得日間精密度，結果見表1。

2.4提取回收率與基質效應 按照“1.7”項下方法處理低、中、高濃度質控血樣各6份，記錄色譜峰面積為A1。另取18份空白血漿處理后獲得上清液，再加入相應的低、中、高濃度質控工作液，記錄色譜峰面積為A2。取相同濃度的低、中、高濃度質控工作液直接進樣，記錄色譜峰面積為A3。提取回收率=A2/A1。基質效應=A3/A2。MPA低、中、高濃度質控的提取回收率分別為96.9%，96.3%，97.9%，RSD分別為3.3%，3.1%，3.2%。MPA低、中、高濃度的基質效應因子分別為100.4%，99.7%，106.5%，RSD分別為2.9%，2.6%，3.9%。表明血漿介質對MPA測定無干擾。

2.5殘留 本實驗考察檢測高濃度樣品(40 μg·mL-1)后在空白血漿中的殘留，結果顯示，MPA殘留為0.07%，符合生物樣本分析的要求。

2.6穩定性實驗 據文獻報道MPA的全血標本在室溫放置2 h[14]，以及25 ℃放置1 d穩定[15]，因此，本研究不再重復考察MPA在全血標本中的穩定性。本研究考察MPA低、中、高濃度血漿質控品各3份處理后，室溫放置1 d，4 ℃避光放置 1,3,7 d的穩定性。同時，考察低、中、高濃度質控品4 ℃放置7 d、-20 ℃ 放置1個月和3個月的穩定性以及-20 ℃ 凍融3次的穩定性。結果表明前處理后的樣本4 ℃避光7 d穩定，血漿樣本保存于-20 ℃3個月穩定，反復凍融 3 次穩定。

2.7MPA濃度檢測在心臟移植患者中的應用 6例心臟移植患者按給予MMF 1 g后，血漿中霉酚酸變化的藥時曲線見圖2，藥動學參數如下：tmax為(1.83±1.13)h，Cmax為(7.58±5.09)μg·mL-1，AUC0-12為(26.58±7.23)μg·mL-1·h，AUC0-∞為(37.41±14.42)μg·mL-1·h，t1/2為(7.53±8.01)h，CL/F為(29.36±7.78)L·h-1，Vd為(258.80±177.96)L。30例患者按0.5 g ,q12h劑量服用MMF至少7 d后血漿MPA穩態谷濃度的分布見圖3，MPA穩態谷濃度在0.37～3.83(1.48±0.88)μg·mL-1之間波動，個體間變異高達59.2%，提示有必要在該人群中開展MPA治療藥物濃度監測。

表1 LC-MS/MS測定MPA的準確度和精密度

圖2 6例心臟移植患者單次給藥后MPA藥-時曲線

圖3 30例心臟移植患者血漿MPA穩態谷濃度分布

3 討論

MMF是目前器官移植術后常用的免疫抑制藥，常與鈣調磷酸酶類抑制劑(CNI)和糖皮質激素組成三聯免疫抑制治療方案。MMF需在體內代謝為活性的MPA才能發揮作用，而體內MPA暴露水平與急性排斥反應的發生具有顯著的相關性。研究顯示，MPA與環孢素A合用時谷濃度應維持在1.0～3.5 μg·mL-1，與他克莫司聯用谷濃度應維持在1.9～4.0 μg·mL-1；與環孢素或他克莫司聯用時AUC0～12 h都應維持在30～60 μg·mL-1·h[16]。然而，MPA個體差異大，受多方面因素(如患者病情、體內白蛋白水平、飲食、肝功能等)的影響，難以保證MPA暴露量維持在目標水平內。因此，開展MPA的TDM具有十分重要的臨床意義。

目前，臨床常用的MPA檢測方法主要基于免疫原理，如酶放大免疫技術(enzyme multiplied immunoassay technology，EMIT)[17]。該方法有商品化試劑盒，樣本檢測方便快捷，適用于MPA的常規監測。但該方法存在著缺點，如檢測的特異性不高，存在交叉反應，檢測結果容易受代謝物以及相似物質的干擾，使得檢測結果偏高[18]。另外，該方法MPA的線性范圍在0.1～15 μg·mL-1[17]，常常會導致某些患者峰濃度值超出檢測限，適用性差。因此，采用治療藥物監測(TDM)檢測的金標準LC-MS/MS法建立一種適用于臨床MPA檢測及藥動學研究的方法十分必要。目前，國內外已有許多關于LC-MS/MS法檢測MPA的報道[19]，檢測方法各具優缺點，如許多文獻采用在線固相萃取技術進行樣本前處理，成本高；定量范圍窄(<20 μg·mL-1)難以滿足臨床檢測需求；流動相成分復雜等特點。而本文建立的方法最大特點在于樣本前處理僅采用乙腈沉淀蛋白，高速離心后進樣分析，整個操作過程簡單方便、樣本分析時間短、流動相成分簡單、檢測范圍可滿足臨床檢測需求。

MMF在健康人、腎移植、肝移植患者體內的藥動學研究已有諸多報道[8-10,20]，但在心臟移植患者中藥動學資料還很少。本研究將建立的方法用于心臟移植患者單次服用MMF的藥動學研究發現MPA藥動學在心臟移植患者中存在較大個體差異，單次給藥后腸肝循環不明顯。此外，筆者還將此方法用于30例心臟移植患者MPA穩態谷濃度的測定，發現服用MMF 0.5 g，q12h達穩態后MPA濃度均在1.48 μg·mL-1，此結果高于DENOFRIO 等[21]報道聯用1 g,q12h MMF和環孢素A達穩態后MPA谷濃度均值為1.2 μg·mL-1。本研究結果偏高的原因可能為合并使用環孢素A時，因為環孢素A干擾MPA的肝腸循環，可將MPA降低30%～50%；合并使用他克莫司時則不干擾MPA代謝。目前，心臟移植患者合并使用MMF和他克莫司后，MPA藥動學以及藥動學參數與臨床療效的關系尚不明確，期望未來的研究中通過本中心病例積累能得到MPA藥動學變化規律并制定出適宜的心臟移植患者MPA治療窗，為推進該人群個體化治療做出積極貢獻。