加味黃芪建中湯對脾虛Lewis肺癌小鼠QKI7、Wnt1及MMP2表達的影響

朱偉 包素珍 姜濤 錢鈞 魏自太* 王彩云

肺癌作為全球常見的惡性腫瘤之一，已成為較多國家病死率最高的惡性腫瘤［1］。由于大部分肺癌患者在確診時已是晚期，或已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，錯過最佳的治療機會，故5年生存率＜15%［2］。因此如何阻止肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是研究者關注的重點。現(xiàn)代研究表明，肺癌的發(fā)生多與免疫力下降有密切關系。中藥復方針對氣虛證的治療不僅能在一定程度上改善患者的免疫功能，同時還可明顯抑制肺癌細胞增殖、侵襲及遷移等生物學行為能力的改變，從而有效改善腫瘤血管的生長狀態(tài)，抑制肺癌的進展［3］。本文通過觀察加味黃芪建中湯對脾虛Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Wnt1、QKI7及MMP2表達的影響，探討其治療脾氣虛證肺癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級C57BL/6小鼠50只，6～8周齡，體重（20±2）g，均為雌性，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證：SCXK（滬）2013-0016。實驗時間2017年8月至2018年3月。

1.2 藥物制備 加味黃芪建中湯組成：黃芪9g、白芍18g、桂枝9g、甘草6g、生姜10g、大棗10g、飴糖30g、浙貝母10g、白花蛇舌草30g、仙鶴草12g（由浙江中醫(yī)藥大學濱江門診部提供）。上述藥物經(jīng)水煎、過濾、濃縮、滅菌后制成湯劑（含生藥濃度為1mg/ml）。生大黃浸出液：生大黃300g，加入1800ml蒸餾水后攪拌混均，放入50℃的水浴箱中，攪拌1次/30min，6h后絞液去渣，再倒入負壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，用50℃水浴濃縮制成生大黃浸出液（含生藥濃度為1mg/ml）。上述制劑放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及儀器 D-木糖標準品儲備液2ml×1支（批號：20161115，南京建成生物工程研究所）；標準品稀釋液10ml×1支（批號：20161002，南京建成生物工程研究所）；胃泌素放射免疫分析藥盒（批號：20161123，南京建成生物工程研究所）；兔抗小鼠 QKI7（一抗）（Merck-Millipore，批號：2900158）；兔抗小鼠Wnt1抗體（一抗）（CST，批號：324114-1）；兔抗小鼠MMP2抗體（一抗）（R&D，批號：0417041）；免疫組化Power Vision二步法試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公 司 ）；PBS 液：NaCl 185g、Na2HPO4.12H2O 58g、NaH2PO4.12H2O 3g、蒸饋水1L混勻。rTdT 緩沖液：Buffer 45μl、MIX 5μl、rTdT 1μl配 制 成 50μl rTdT緩沖液，避光。甲醇、蘇木精染液、伊紅染液（南昌雨露實驗器材有限公司）；液氮（杭州悅通氣體技術開發(fā)有限公司）；無水乙醇（上海生工生物工程有限公司）；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；W-O恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；P-250A-B型高速多功能粉碎機（浙江永康久品工貿(mào)有限公司）；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；HYC-118海爾醫(yī)用冷藏箱（山東青島海爾股份有限公司）；切片機（德國徠卡儀器有限公司）；自動組織包埋機（德國Microm International GmbH）；倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5417R型離心機（德國艾本德股份公司）；NanoDrop 2000微量核酸蛋白檢測儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Bio-RADIQ5 Multicolor-Real-Time熒光定量PCR儀（Bio-RAD）。

1.4 模型建立及給藥 脾虛小鼠模型建立：將50只C57BL/6小鼠在動物實驗中心常規(guī)適應飼養(yǎng)1周，隨機取30只，采用苦寒瀉下法+饑餓法+疲勞法建立脾氣虛模型。具體步驟：給予大黃濃縮液灌胃，1ml/（20g·d），分2次，同時每日游泳至力竭，并間隔1日節(jié)食，連續(xù)14d。從第3、4天起小鼠開始出現(xiàn)大便溏瀉；5d后出現(xiàn)不同程度的嗜臥、倦怠等癥狀。期間由于灌胃不當及游泳溺水死亡3只。造模第15天，分別從正常和模型小鼠中隨機各取10只小鼠，稱重并眼球取血后，測血清D-木糖和胃泌素水平，以驗證脾虛模型成功。脾虛模型成功后，停止大黃灌胃。荷瘤小鼠模型建立：取傳代后第13天C57BL/6荷瘤小鼠（由浙江中醫(yī)藥大學動物研究中心提供），脫頸椎處死，在無菌條件下，對操作部位皮膚以酒精消毒，小鼠皮膚下剝?nèi)⌒迈r無壞死Lewis腫瘤組織，置于無菌平皿中；用消毒剪刀將腫瘤塊剪碎，加生理鹽水于研磨器中反復研磨，于200目篩網(wǎng)過濾，制成腫瘤細胞懸液；于顯微鏡下計算癌細胞數(shù)目，用生理鹽水將腫瘤細胞濃度調(diào)整為1×107個/ml；將正常組10只和脾虛組17只小鼠接種腫瘤，取上述腫瘤細胞懸液0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，采集腫瘤組織到最后一只小鼠接種完成控制在＜2h。在接種Lewis腫瘤組織后，隨機將實驗小鼠分為3組：①單純肺癌組（10只）：生理鹽水灌胃，1次/d，0.4ml/次；②脾虛肺癌組（8只）：生理鹽水灌胃，1次/d，0.4ml/次；③脾虛肺癌用藥組（9只）：中藥加味黃芪建中湯灌胃，1次/d，0.4ml/次；各組按以上方法給藥，連續(xù)15d后，進食不禁水12h，第16天脫頸椎處死小鼠。

1.5 觀察指標 小鼠眼眶取血0.4ml，分離血清后置于-80℃冰箱。比色法測定血清D-木糖含量，用Elisa法測定血清胃泌素水平，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。檢測腫瘤重量、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)：在處死小鼠后，無菌剝?nèi)∑は铝鰤K稱重；分離氣管，取出肺臟，浸入Bouin液固定后對肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)觀察計數(shù)。

1.6 RT-PCR檢測腫瘤組織Wnt1、QKI7含量 采用Trizol提取總RNA，微量核酸蛋白檢測儀測定濃度，取5μg總RNA，利用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司）逆轉(zhuǎn)錄為c-DNA，逆轉(zhuǎn)錄條件42℃，45min；70℃，10min后迅速置于冰上備用。引物由上海生工生物工程有限公司負責合成，以Wnt1為內(nèi)參，小鼠Wnt1上游引物：5'-CTACTGGCACTGACCGCTCT-3’，下游引物：5'-CTTGGAATCCGTCAACAGGT’，小鼠QKI7上游引物：5'-GCTGAAGAGAGCGGTTGAAG-3’，下游引物：5'-GCGTCTCTGTAGGTGCCATT-3’，反應條件：95℃，3min；95℃，15s；56℃，20s，共40個循環(huán)，檢測熒光信號。每個樣品做3個平行管，各個基因的相對表達水平以2-△△Ct進行統(tǒng)計分析。

1.7 免疫組織化學法檢測腫瘤組織中MMP2的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，切片入微波處理液，微波加溫90～98℃10min，冷卻后蒸餾水稍洗，3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶5min，PBS洗3次3min，滴加第一抗體置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，滴加第二抗體置37℃孵育30min，PBS洗3次3min，DAB-H2O2顯色，流水沖洗，Mayers蘇木素復染細胞核1～2min；流水沖洗數(shù)分鐘，常規(guī)脫水封片。MMP2陽性表達均在胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，每張片在400倍視野下任意選取10個視野，每張片最少計數(shù)500個細胞，計算每一百個細胞中的陽性細胞數(shù)采用百分數(shù)計數(shù)法。MMP2陽性表達率=陽性表達數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料數(shù)以（s）表示，兩組間用t檢驗，多組間用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組與脾氣虛證模型組小鼠血清D-木糖和胃泌素水平比較 見表1。

表1 正常組和脾氣虛組小鼠D-木糖和胃泌素變化（s）

表1 正常組和脾氣虛組小鼠D-木糖和胃泌素變化（s）

注：與正常組比較，*P＜0.05

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2.2 肺癌組、脾虛肺癌組和脾虛肺癌用藥組小鼠皮下腫瘤重量及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較 見表2。

表2 各組腫瘤組織中瘤重及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)情況比較（s）

表2 各組腫瘤組織中瘤重及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)情況比較（s）

注：與單純肺癌組比較，*P＜0.05；與脾虛肺癌組比較，#P＜0.05

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2.3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較 見表3。

表3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較（s）

表3 各組腫瘤組織中Wnt1表達情況比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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2.4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較 見表4。

表4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較（s）

表4 各組腫瘤組織中QKI7表達情況比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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2.5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較 見表5、圖 1～3。

表5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較（s）

表5 各組腫瘤組織中MMP2陽性表達率比較（s）

注：與肺癌對照組比較，*P＜0.05；與脾虛證肺癌組比較，#P＜0.01

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圖1 單純肺癌組MMP2的陽性表達

圖2 脾虛肺癌組MMP2的陽性表達

圖3 脾虛肺癌用藥組MMP2的陽性表達

3 討論

腫瘤微環(huán)境（TME）主要是由基質(zhì)細胞和腫瘤細胞組成，TME包含巨噬細胞和淋巴細胞等免疫細胞、構(gòu)成血管的細胞、脂肪細胞、成纖維細胞和細胞外基質(zhì)（ECM）等。而在這些細胞中，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境（TME）中最重要的組成部分，其能夠促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wnt1作為Wnt家族中的一員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義［4］。Wnt1可通過合成特殊的RNA和蛋白質(zhì)，進入細胞核促進細胞DNA復制，促進細胞分裂增殖。Wnt1可作為評價肺癌患者預后的一個重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白QKI與低氧誘導因子（HIF-1）對腫瘤細胞的細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細胞周期均有重要的調(diào)控作用，且與預后相關［5］。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）是一組由結(jié)締組織細胞分泌的、參與細胞外基質(zhì)構(gòu)成的蛋白酶家族，MMP2是MMPS家族的一員，大量研究表明，MMP2在多種腫瘤組織中呈過度表達，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關［6］。

本實驗加味黃芪建中湯為黃芪建中湯加白花蛇舌草、仙鶴草、浙貝三味中藥，白花蛇舌草主要功效是清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕。臨床常應用白花蛇舌草配方治療各種癌癥。仙鶴草具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒等功效，研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草還具有較強的抗癌功效。浙貝歸肺、心經(jīng)，主要功效為清熱化痰、降氣止咳、散結(jié)消腫。浙貝母堿是中藥浙貝母的主要成分，近年來其抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)耐藥的作用逐漸得到認同。在補脾基礎上，加強抗腫瘤功效。

本資料中，造模后脾虛小鼠血清D-木糖和胃泌素水平較正常組明顯下降，并且小鼠出現(xiàn)納少、便溏、成群蜷縮、四肢乏力、體重下降等脾虛典型癥狀。對模型組小鼠接種Lewis腫瘤后，瘤體較單純肺癌組明顯增大，RT-PCR結(jié)果顯示在脾虛肺癌小鼠中Wnt1、MMP2的表達較單純肺癌組明顯升高，QKI7的表達明顯降低。而經(jīng)過加味黃芪建中湯治療后，小鼠瘤體較脾虛肺癌組明顯減小，相對單純肺癌組也有縮小的趨勢，提示加味黃芪建中湯對脾虛證肺癌有較好的療效，同時Wnt1、MMP2的表達有明顯下降，而QKI7的表達明顯升高。表明加味黃芪建中湯可通過調(diào)節(jié)QKI7、Wnt1及MMP2的表達，抑制脾虛證Lewis肺癌腫瘤細胞增殖的作用。