半滑舌鰨性別決定和性別控制育種研究進展與展望*

張全啟， 王旭波， 劉金相

(1. 中國海洋大學海洋生命學院海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

性別是最普遍的生物學現象，許多生物的雌性和雄性在形態、生殖策略和行為上存在顯著差別。性別的形成受到性別決定的控制，又受到性腺分化的影響。性別決定與性腺分化相互聯系又有所區別；性別決定是確定性腺分化趨向，而性腺分化是具雙向潛力的未分化性腺經過程序性發生的一系列事件，發育成精巢或卵巢，并出現第二性征的過程。

硬骨魚作為低等的脊椎動物，是脊椎動物中最大類群，其性別決定機制和性別分化呈現出多樣性，包括遺傳決定(GSD)、環境因素決定(ESD)和兩者共同決定(GSD + ESD)等模式[1-3]。此外，硬骨魚的性別表型不但有雌雄異體，還存在雌雄同體、性逆轉等特殊的生物學現象。

硬骨魚獨有的以上特點，為研究生物的性別決定和性腺分化等生物學過程提供了豐富的遺傳材料，可作為理想的模式生物來研究性別相關的生物學過程。闡明硬骨魚的性別決定方式，不僅有助于完善生物性別決定的基礎知識，對基礎研究貢獻巨大，在生產上通過性別控制育種也能達到增產效果，具有重要應用價值。鑒于魚類性別決定研究在理論知識和生產實踐中均具有重要意義，國內外科研人員在一系列硬骨魚中展開相關研究，從模式物種斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)，到大型經濟物種尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、大西洋鮭(Salmosalar)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)和河鲀(Takifugurubripes)等均取得了突破性進展[4-9]。

半滑舌鰨屬于鰈形目(Pleuronectiformes)舌鰨科(Cynoglossidae)舌鰨屬(Cynoglossus)是中國黃渤海地區近海底棲魚類，也是重要的經濟物種。該物種雌雄個體差異巨大，雌性成體個體體長是雄性個體的2～4倍，雌性成熟個體的體重可達雄性的8～10倍[10-11]。目前半滑舌鰨工廠化養殖在中國北方地區發展迅速，已成為規模化養殖的優勢品種之一。然而，由于半滑舌鰨繁殖周期長，且雌雄個體規格差異巨大，在同等條件下，如果養殖全雌魚或高雌性比例群體，可極大提高單位面積產量，進而獲得更高的經濟效益。因此，研究半滑舌鰨性別決定的分子機制，為開展人工性別控制、單性品種或高雌性比例的養殖群體等提供理論基礎。

已有研究表明，半滑舌鰨有明顯的性染色體，屬于ZZ/ZW性染色體類型[12]，同時其性別決定不僅受遺傳因素決定，還受到環境因素的調控[8]。另外研究人員通過篩選半滑舌鰨雌性特異分子標記，可以準確的識別出其遺傳性別[13-14]。該物種獨特的生物學特征為研究硬骨魚的性別決定提供了理想的模型。本綜述就半滑舌鰨性別決定、環境因素誘導的性逆轉現象、性別控制育種等方面取得的重要進展和研究成果分別進行綜合介紹，并與其他魚類在相關領域的研究進展進行比較分析。

1 半滑舌鰨性別決定研究進展

性別決定由性別決定基因啟動，當性別決定基因表達后，經過一系列級聯反應，使生物體表現出雌雄性別表型。目前為止，僅在少量物種中鑒別出性別決定基因。在高等脊椎動物的性別決定基因比較單一，但在硬骨魚中，性別決定系統異常復雜，其性別決定基因呈現出多樣性，到目前為止在硬骨魚中發現的性別決定基因如表1所示。

表1 硬骨魚性別決定基因一覽表Table 1 Reported sex differentiation genes in teleost

對半滑舌鰨性別決定的研究起始于該物種存在性別二態性，雌性個體遠大于雄性。周麗青等首先通過染色體觀察證明，半滑舌鰨有明顯的性染色體，其性別決定屬于ZZ/ZW類型，雌性個體擁有一個異形的W染色體[12]。在近二十年的研究中，通過差減文庫分析、基因克隆和性腺發育各時期表達量的變化等技術手段，發現和解析了一系列在雌雄性腺中表現出差異表達的基因，包括Amh、Amhr2、Wnt1a/b、Dmrt1、Gsdf、Sox9a、Dazl、Sf1、Figla、Sox10、Foxl2、Zp3a/b、cyp19a1a、GATA、Rspodin1等[8, 10, 20-27]。這些呈現出雌雄二態性表達的基因，部分偏向于雄性或雌性表達，部分表現為在整個生殖周期過程中動態表達，其功能涉及類固醇激素的合成和調控、性腺發育、配子發生、成熟過程的調節等。

伴隨高通量測序技術的普及，半滑舌鰨轉錄組、基因組和甲基化組測序等技術平臺都相繼成熟，為后續性別決定基因的篩選提供了更為豐富的參考信息。通過對半滑舌鰨精巢和卵巢等轉錄組的測序分析，篩選出大量雌雄表達差異的基因[28]。隨著半滑舌鰨基因組測序完成，結合雌魚、雄魚和偽雄魚轉錄組和甲基化組分析，半滑舌鰨的性別決定基因篩選范圍進一步縮小，初步認為Dmrt1基因是半滑舌鰨的性別決定基因[8, 28-29]。Cui等用基因編輯技術對半滑舌鰨Dmrt1基因進行了基因編輯，發現ZZ型突變體的性腺發育成卵巢樣精巢，且精子發生過程被阻斷，該突變體比野生型ZZ個體表現出更快的生長速度，其形體和大小與野生型ZW雌魚類似。在基因編輯的突變體中，研究人員還發現ZW型雌雄同體突變體，上下兩側性腺分別呈現出精巢和卵巢結構。分子生物學檢測發現，上側精巢中未發現Dmrt1突變，而下側卵巢的性腺中56%的Dmrt1基因發生了突變，推斷這是一個基因編輯的偽雄魚嵌合體。通過上述基因編輯結果，Cui等認為Dmrt1基因是半滑舌鰨雄性決定基因，同時也是雄性精巢發育必不可少的[18]。

Dmrt1基因屬于Dmrt基因家族，包含典型性的DM結構域，一系列研究表明該基因在哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類中與性別決定與性腺分化、雄性性腺的發育和維持密切相關[30-35]。在許多物種中，Dmrt1基因已被廣泛研究，包括牙鲆(Paralichthysolivaceus)、尼羅羅非魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、青鳉、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、東方紅鰭鲀、革胡子鯰(Clariasgariepinus)、黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)、許氏平鮋(Sebastesschlegelii)和斑馬魚等，該基因在大部分硬骨魚中只在精巢和卵巢中表達，且在精巢中的表達量顯著高于精巢[31，34，36-45]。在以前的研究中發現，青鳉Dmrt1的同源基因DMY是雄性性別決定基因，該基因是Dmrt1基因發生復制后轉移Y染色體上產生的，當DMY基因突變或過表達后，都會出現性逆轉現象[6-7]。與青鳉類似，Yoshimoto等在對兩棲動物光滑爪蟾(Xenopusleavi)的研究中也發現，DMW基因是其性別決定基因，該基因是Dmrt1在W染色體上的一個特殊拷貝，當DMW基因過表達或敲降后，會表現出性逆轉現象[46-47]。

在半滑舌鰨中，Dmrt1基因已被克隆，該基因由5個外顯子和4個內含子組成。組織表達模式分析發現，Dmrt1基因是雄性精巢特異表達基因。在不同發育時期，Dmrt1基因在雌雄個體中呈現出顯著差別，在雌魚性腺中基因檢測不到Dmrt1基因的表達。在雄魚中，從發育到48天的仔魚中檢測到Dmrt1開始表達，70天表達開始升高，1年齡時，達到最高值[48-49]。染色體定位和基因組分析發現，該基因位于Z染色體上，原位雜交結果顯示，Dmrt1主要在精巢的生殖細胞(Germ cell)和將來分化成支持細胞的體細胞(Presomatic cell)中表達[29]。這些結果都表明Dmrt1在半滑舌鰨性別決定或(和)性腺分化中發揮了重要作用。但是，單純根據少數基因編輯個體的表型就斷定Dmrt1是其性別決定基因這一結論有待進一步確認。首先，基因編輯的突變體都是原代個體，個體數量不明；再者，基因編輯發生在受精卵或胚胎發育的早期，而性腺分化是在變態后的幼魚時期，基因編輯如何能夠獲得上述一側性腺被編輯雌雄同體個體，或者說基因編輯的細胞為什么只在一側性腺中出現，尚無法解釋；此外，當Dmrt1基因過表達后，會出現怎樣的性別表型變化，亦有待進一步研究。

2 環境因素誘導的性逆轉現象

在高等脊椎動物中，性別一旦形成，一般比較穩定，不容易發生性逆轉現象。在低等脊椎動物中，其性別由遺傳物質和環境因子共同決定，魚類作為低等的脊椎動物，在發育過程中其性別的可塑性較大，除了遺傳因素的調控外，外界環境對其性別分化的影響也非常大。外界環境因子中的溫度對性別分化的影響尤其重要。在魚類中，性腺分化過程中由于環境因素影響而分化為假雄魚和假雌魚這一現象被稱為性逆轉現象(Sex reversal)，產生的假雄魚或者假雌魚被成為偽雄魚或者偽雌魚。大西洋銀漢魚(Menidiamenidia)是首先被發現溫度能改變性別比例的物種[50]，隨后的研究中發現很多硬骨魚中發現類似現象[1,3]。性別比例的偏離主要是性逆轉造成的，一般情況下是雌魚性逆轉成偽雄魚，導致雄性比例偏高。半滑舌鰨性逆轉現象產生的原因也多是環境溫度的變化過高或過低溫度能誘導雄魚的產生[1-2，51]。本實驗室對不同養殖場來源的生理雄魚進行了遺傳鑒定，并跟蹤調查了這些養殖群體苗種生產企業苗種培育水溫情況，結果發現，在保苗階段，或者說在苗種性別分化階段，不同的苗種培育溫度對后代的生理性別產生較大影響(見表2)。溫度越高，偽雄魚的比例也越高，育苗水溫達到24 ℃時，生理雄魚中偽雄魚的比例可達37%。保苗溫度與偽雄魚比例間存在極顯著的正相關關系(P=0.986)。

表2 半滑舌鰨不同人工養殖群體的生理雄魚中偽雄魚的比例Table 2 Detection of pseudomales in different cultured stocks of Chinese tongue sole

①Male stocks(Batch);②Source of fingerling(Batch);③Time of fingerling production;④Temperature;⑤Number of individuals;⑥Average body weight;Number of pseudomalse;⑧/Percentage of pseudomales

一系列研究發現，高溫或雄性激素誘導以及養殖群體中自然性逆轉的偽雄魚，其表現出的精巢性狀跟雄魚類似[8,48,52-53]，在進行相關遺傳學研究時必須對其進行區分。由于半滑舌鰨存在明顯的W性染色體，且其較大易于區分，Wang等通過染色體切割技術對W染色體進行了切割，建立了W染色體特異的基因組文庫，從而開發了雌性特異的分子標記[54]；另有研究分別開發了性別特異的AFLP標記和SSR標記[55-56]。這些性別特異分子標記的開發為鑒別半滑舌鰨的遺傳性別提供了有利工具，結合表型性別的觀察，可以準確的鑒定雌魚、雄魚和偽雄魚(見圖1)。

(A.遺傳雌雄的PCR擴增結果，雌性有特異的條帶；B.養殖群體的生理雄魚中偽雄魚的識別，箭頭所指為偽雄魚。A.PCR amplification results in genetic males and females, females with a specific band. B.Identification of pseudomales from physiological males. Arrows show the pseudomales with a female specific band.)

圖1 半滑舌鰨遺傳性別的分子鑒定
Fig. 1 Genetic sexing of Chinese tongue sole

性逆轉產生的偽雄魚在遺傳性別上和雌魚相同，都是ZW型個體，但表型和ZZ型雄性個體相似。深入的分析發現，性逆轉個體的表觀遺傳特性發生了巨大的變化。全基因組甲基化測序發現偽雄魚和雄魚基因組甲基化水平整體比較相似，都表現出較高的甲基化水平，與正常雌魚相比甲基化水平差異顯著[8]。半滑舌鰨性逆轉個體不僅在基因組整體上甲基化水平具有顯著差異，對性別相關基因包括piwi、GATA4、GATA6、cyp19a1a等的啟動子區甲基化水平進行分析發現，在不同性別的個體中這些基因的啟動子區甲基化水平不同，其甲基化模式也存在顯著差別，同時發現這些基因的表達量的變化和甲基化水平呈現出相關性[23-24,52，57]。Liu等最近的研究發現，半滑舌鰨偽雄魚cyp19a1a啟動子區的甲基化水平是雌魚中的兩倍，而且和雄魚的甲基化模式類似。體外實驗結果表明，cyp19a1a啟動子區甲基化水平可影響轉錄因子CREB的結合并調控該基因的轉錄，進一步影響雌雄類固醇激素的比例，從而引起下游一系列級聯反應，進而影響性別表型[52]。

本實驗室前期研究表明，偽雄魚能夠產生有功能的配子，但受精率和孵化率顯著低于正常雄魚來源的精子，其后代的生長性狀與正常雄魚后代存在顯著差異[58]。Shao等研究發現偽雄魚產生的后代生長速率緩慢，同時證明了偽雄魚的表觀遺傳改變可通過遺傳物質傳遞給子代個體[8]。在正常的養殖群體中，半滑舌鰨只有部分雌魚會發生性逆轉發育偽雄魚， Jiang和Li 通過GWAS分析發現，位于Z染色體上的FBXL17基因的SNP位點(A/T)與該現象相關，ZAW型雌魚不會發生性逆轉現象，但ZTW型雌魚較為敏感，在外界環境的影響下容易發生性逆轉[59]。在半滑舌鰨Dmrt1基因第三內含子的SNP(A/G)也有類似現象，當該SNP的基因型為T時，雌性個體易發生性逆轉[60]。綜合上述研究結果，可以推測偽雄魚的產生受到表觀遺傳修飾的調控，某些基因的SNP突變，會引起對環境敏感程度的差別，帶有敏感突變的個體更容易受到環境因子的影響而發生性逆轉。環境因素誘導的性逆轉，尤其是溫度對性別的影響，在兩棲類和爬蟲動物中也有發現[61-62]。關于性逆轉現象產生的分子機制被廣泛研究，不同學者從不同的角度對該問題進行了深入探討，發現類固醇激素、糖皮質激素和表觀遺傳修飾等因素在性逆轉過程中發揮至關重要的作用[63-71]。在爬行類中，Deveson等發現在JARID2和JMJD3剪切過程中內含子保留(Intron retention，IR)可介導澳大利亞蜥蜴(Pogonavitticeps)的性逆轉現象[72]。在溫度敏感型巴西紅耳龜(Trachemysscripta)和美洲鱷(Alligatormississippiensis)中，cyp19a1a能調控類固醇激素的比例，從而改變表型性別[73-74]。在硬骨魚中，關于高溫誘導后趨向雄性化這一現象和表觀遺傳修飾之間的關系在歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)、尼羅羅非魚、虹鱒和半滑舌鰨中已陸續展開，研究發現cyp19a1a基因啟動子區甲基化水平與性別密切聯系[52, 69, 75-76]。在牙鲆中發現FOXL2和SOX9甲基化也呈現出性別二態性[77]。另外，HSPs、TRPs、CIRBPs和microRNA在環境因子對性別的影響過程中發揮重要作用[78-82]。在雌雄同體的尖吻鱸(Latescalcarifer)中dmrt1和cyp19a1不僅存在性別特異的甲基化水平，還存性別特異的剪切[83]。

上述的研究表明，環境因子與遺傳信息互作對半滑舌鰨等許多硬骨魚性別分化的影響體現在表觀遺傳修飾上，通過表觀遺傳修飾，可調控性別決定或性腺分化相關基因及信號通路的表達，從而影響性腺分化和配子發生。然而，在環境影響基因表達調控方面，非編碼RNA的功能卻少有涉及。已有的研究表明，在斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)miR-27b-3p直接靶向piwi2和mov10l1的3’UTR并下調其表達[84]；miR-141 和miR-429在黃顙魚精巢發育和精子發生中發揮重要作用[85]；在黃鱔(Monopterusalbus)中，miR-19a/b能夠直接抑制性逆轉期dmrt1的表達[86]；牙鲆piRNA信號通路基因經歷了快速的進化，它們在雄性精巢中高表達，與雄性偏向的piwi基因的高表達相協調，可能在精巢發育和精子發生中發揮重要功能[87]。這些非編碼RNA是否直接受到環境因子變化的影響，以及相關變化怎樣通過影響相關靶基因的表達調控性腺分化等，均未見報道。因此，在以后的研究中轉錄水平上非編碼RNA對性別分化的調控是值得探討的內容。此外，性別分化相關基因在蛋白水平上磷酸化、乙酰化修飾等對性別分化的影響也有待探討。

3 半滑舌鰨性別控制育種

半滑舌鰨雌性個體遠大于雄性個體，在養殖過程具較高的經濟價值，提高養殖群體的雌性比例或培育全雌苗種對半滑舌鰨的養殖產業意義巨大。對于ZZ/ZW性別決定型的半滑舌鰨來說，培育全雌苗種的理想方法是，首先獲得WW染色體組成的超雌魚，然后通過WW超雌魚與普通ZZ雄魚交配，獲得ZW全雌后代。獲得WW超雌魚的有效途徑有兩個，一是開展雌核發育，能夠獲得ZZ和WW兩種雌核發育個體；另一個是培育或篩選ZW偽雄魚，通過偽雄魚與正常ZW雌魚交配，理論上可以獲得的后代中有四分之一為WW超雌魚。

3.1 半滑舌鰨雌核發育研究

本實驗室通過采集ZZ型雄魚的精子，并參考戈文龍等的方法用紫外線進行失活處理，利用靜水壓力方法誘導雌核發育[88]，成功獲得了多批次雌核發育個體。待雌核發育個體生長至5 cm左右時，隨機選取94尾，提取DNA樣本，與雌性親本及提供精子的雄性親本一起進行PCR分子遺傳性別鑒定。結果表明，所有雌核發育后代的遺傳性別均與雄性親本一致，而與雌性親本不同，缺少W特異的分子標記(見圖2 A)，隨機選取10尾進行染色體觀察顯示，所有個體的染色體組成均為ZZ型(見圖2 C)，沒有觀察到雌雄個體應有的W染色體(見圖2 B)。這一結果表明，雌核發育后代全部為ZZ型遺傳雄性，WW型雌性個體不能存活。Chen等報道在其雌核發育研究時，孵化2天的仔魚中發現有WW超雌魚苗[55]，但未對較大的幼魚進行檢測。顯然，WW超雌魚未能成活到5 cm左右的稚魚，那么，WW雌魚到底什么時候死亡的，有待進一步探討。

(A：雌核發育用雌性親本、雄性親本及獲得后代的分子標記檢測，所有后代全部為雄性；B：一般雌雄個體的染色體，箭頭示W染色體；C：雌核發育后代的染色體，全部為ZZ型。A: PCR amplification of female and male parents and the gynogens, all gynogens do not have the female specific marker. B: Chromosomes of normal female individual with arrow indicating the W chromosome. C: Chromosomes of diploid gynogen, with all individuals show ZZ chromosomes.)

圖2 半滑舌鰨雌核發育后代的性別特異分子標記檢測及染色體觀察
Fig. 2 Identification of gynogens with female specific marker and chromosome observation

3.2 利用偽雄魚培育WW超雌個體

利用雌性特異標記篩選方法[14, 54]，于2006—2007年分別從2005和2006年培育的苗種中篩選獲得偽雄魚817尾(見表2)，分別于2007和2008年進行了偽雄魚后代的培育，共培育苗種5萬余尾。至苗種一月齡時，分別從2007和2008年度的苗種中各取400尾，用雌雄特異分子標記后代進行了遺傳性別鑒定，結果顯示，2007年度偽雄魚的后代中，遺傳雌性的比例為53.6%，同期普通對照組雌性比例為47%，兩者沒有顯著差異；2008年度偽雄魚的后代中，遺傳雌性的比例為48.5%，同期普通對照組雌性比例為48.3%，兩者也沒有顯著差異[58]。

從分子標記確認的一月齡遺傳雌性仔魚中，隨機挑取200尾進行了染色體觀察，結果有167尾成功地觀察點清晰可辨核型的染色體，這些個體全部為ZW型遺傳雌性，未觀察到WW個體的存在。在前期利用FISH雜交研究rDNA分布時發現，在半滑舌鰨雄性染色體組中有3對雜交信號，而在雌雄染色體組中，有7個明顯的雜交信號，除與雄性相同的3對信號外，在W上有一個較大區段的rDNA分布(見圖3)。為了驗證對偽雄魚后代分子鑒定及染色體觀察的結果，以18S rDNA為探針，對觀察到的染色體進行原位雜交，結果發現，所有觀察到的遺傳雌性個體的染色體組中，都有且只有7個雜交信號，包括3對成對的信號和一個W染色體特異信號(見圖3)。充分證明，在偽雄魚的后代中，不存在WW超雌魚。

(A：在雄性染色體組中有3對雜交信號，分別為箭頭、#箭頭和空箭頭；B：雌性染色體組中有7個雜交信號，小箭頭示W染色體特異rDNA信號。偽雄魚的所有雌性后代染色體組都與B相同。A: Male karyotype shows 3 pairs of rDNA bearing chromosomes, arrows, # arrows and hollow arrows; B: Female karyotype shows 3 pairs of rDNA bearing chromosomes and an additional big W chromosome signal.)

圖3 18S rDNA在半滑舌鰨染色體組中的分布
Fig.3 Distribution of 18S rDNA in the chromosomes of Chinese tongue sole

對2007年度培育的苗種進行了養殖測試，2008年度培育的苗種，因與2007年度組一樣，經過遺傳鑒定也沒有發現WW超雌魚，所以，直接放棄養殖測試。結果還發現，偽雄魚后代生長速度顯著低于普通組，至7月齡時，偽雄魚后代中遺傳雌性個體的平均體長為18.3 cm，對照組為22.2 cm，對照組比偽雄組大21.3%，偽雄組和對照組遺傳雄性個體的平均體長分別為16.7和17.6 cm，兩者沒有明顯差異(見表3)，因此，偽雄魚后代在整體是生長較慢是由于其中遺傳雌雄個體生長速度較慢造成的。

首先，關于偽雄魚后代的雌雄比例，本研究發現其雌雄比為1∶1，與普通雄魚后代比例一致。理論上說，ZW×ZW雜交后代的比例為ZZ∶ZW∶WW=1∶2∶1，由于后代中不存在WW個體，且ZW個體與ZZ個數相等，因此，很容易想到雜交親本中一方來源的W配子不存在或不能正常受精發育。事實上，Cui等后來的研究證實，偽雄魚不能產生W型精子[60]，這證實了本研究的觀察結果，即：WW超雌個體是不存在的，通過偽雄魚培育WW超雌魚進而培育全雌品種的途徑是行不通的。

關于偽雄魚后代的的生長速度，發現偽雄魚后代生長速度明顯較對照組慢，且這些差異主要是由于偽雄魚后代中遺傳雌性的生長速度慢造成的。Shao等研究也發現偽雄魚的后代生長緩慢，且其中生理雄性比例極高[8]，后來，Jiang和Li證實，在半滑舌鰨Z染色體上的FBXL17基因存在一個SNP位點(A/T)，ZTW型個體對外界溫度變化較為敏感，更容易發生性逆轉[59]，Dmrt1基因第三內含子的SNP(A/G)也與雌性個體溫度易感性相關[60]。因此，偽雄魚這一性狀是遺傳的，容易發生性逆轉變成偽雄魚的個體，多數攜有溫度敏感型SNP位點，其后代也繼承了相應SNP位點，也容易發生性逆轉成為偽雄魚。

表3 半滑舌鰨偽雄魚后代中遺傳雌雄個體的比例及其生長狀況比較Table 3 The percentage and the growth rate of male and female offspring of pseudomales

3.3 半滑舌鰨三倍體的培育與養殖實驗

由于半滑舌鰨性染色體結構的特殊性，使得全雌苗種的諸多嘗試均未獲得理論上預料的成果，因為許多動物中都已證實三倍體比二倍體有一定的生長優勢[89-91]， 國內不少學嘗試了半滑舌鰨多倍體育種。劉志鵬等通過冷休克誘導方法成功誘導出半滑舌鰨三倍體，發現雌雄ZWW/ZZZ核型出現的頻率為1∶1，雌性性別比例并沒有顯著提高，同時在誘導的三倍體中沒有發現ZZW型雌魚[92-93]。李文龍用靜水壓力誘導了半滑舌鰨三倍體和四倍體，，研究發現三倍體同二倍體相比，性腺發育會出現明顯的受阻現象，性別鑒定發現，三倍體中雌魚的比例僅為11%，雌性率顯著低于正常二倍體群體，三倍體生長速度和二倍體沒有顯著差異[94]。為何不同處理組的三倍體在雌雄比例上存在較大差異，有待進一步探討，但已有的研究成果表明，通過誘導多倍體提高半滑舌鰨的雌性率或者實現性別控制育種的方法也是不可行的。

4 總結與展望

半滑舌鰨的雌雄差異及其性染色體的存在，使其成為性別決定、性腺分化和性別控制育種的優選研究對象。在水產養殖中雌性個體生長快、個體大，養殖效益高，有效提高雌性比例是水產養殖企業所祈求的。然而，在苗種生產過程中，為了保證苗種成活率和生長速度，生產企業往往采用較高的水溫，這就造成了苗種中高比例的雌魚發生性逆轉，成為生理雄魚。為了解決雌性苗種偏少，培育全雌苗種問題，國內多個團隊開展了多年的努力，包括傳統的細胞工程育種如雌核發育和多倍體誘導，通過篩選偽雄魚進行雜交育種，通過基因編輯等手段，根據已有的研究成果發現，相比XY型性染色的物種，傳統的育種方法尤其是細胞工程育種，對半滑舌鰨的性別控制育種并不適用，通過偽雄魚進行雜交的方法也無法達到理想的目的，原因是半滑舌鰨性染色體分化較大，ZW偽雄魚無法生產W型精子，雌核發育和偽雄魚雜交均無法獲得理想中的WW超雌魚，因此，要通過超雌魚培育全雌品種的路徑是不可行的。

近年來伴隨新技術的開發和應用，尤其是基因編輯技術的發展，該技術在模式動植物中展現出顯著的優勢，在作物性狀改良方面效果顯著，在水生動物中也得到應用，尤其是在淡水生物中，相關研究工作也廣泛展開。受制于海水物種的特殊性，基因編輯技術在海洋動物中的應用相對滯后。在最近的研究中，Cui等通過TALEN技術對半滑舌鰨進行了基因編輯，運用該技術成功敲除Dmrt1基因，敲除Dmrt1基因的遺傳雄性個體表現出和雌性個體相似的表型[18]。但怎樣利用基因編輯技術在半滑舌鰨上實現性別控制育種，提高雌性比例，還有待大量的研究。

已有全基因組關聯分析研究證實，半滑舌鰨中存在對環境敏感的SNP位點[59-60]，攜有敏感位點的雌雄個體容易受到高溫等環境因素誘導產生的性逆轉，從而減少養殖群體中生理雌性個體的比例，降低養殖效益。因此可以預期，利用分子篩選技術，在養殖苗種培育前剔除帶有敏感SNP位點的親本，保留對溫度不敏感的親本，雖然該方法無法獲得全雌群體，但理論上可以有效地減少人工苗種中偽雄魚的出現比例，提高養殖群體中生理雌魚的比例，提高養殖效益，因此，這可能成為半滑舌鰨性別控制育種的有效手段和新途徑。