多物種混合轉錄組測序(msRNA-seq)及其在海洋生態學研究中的應用*

楊官品, 孫詩陽, 潘克厚, 郭 栗

(中國海洋大學 1. 海洋生命學院； 2. 海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室； 3. 進化與海洋生物多樣性研究所； 4. 水產學院，山東 青島 266003)

轉錄(Transcription)是中心法則(Central dogma)概括的基因表達的第一個關鍵步驟。細胞基因轉錄本集合反映細胞生理狀態, 是“基因組-轉錄組-蛋白組-性狀”鏈條的第二個環節, 是生物基因型-表現型的中間橋梁之一。盡管離生物表型還隔著蛋白組, 但轉錄組在數據獲取、參考數據豐富度和數據解讀方面較蛋白組有極顯著的方便性。隨著設備的更新和軟件工具和試劑的升級換代, 轉錄組分析成本越來越低。從RNA印跡雜交(Northern blotting hybridization)、實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)、基因芯片(Microchip或microarray)到現在普及的全轉錄組鳥槍法測序(Whole transcriptome shotgun sequencing, RNA-seq), 獲取基因轉錄本豐度信息的效率越來越高。目前, RNA-seq主要用二代測序技術(但四代納米孔測序也能做到定量轉錄本豐度), 依賴但不絕對依賴參考基因組或全長轉錄組數據[1]。

通常熟悉的RNA-seq, 一般都是單一物種或單一細胞類型在不同時間和空間序列點上的分析, 通過與對照比較, 獲取轉錄本豐度顯著差異的基因，即差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs), 解析不同發育時期和環境(不同時空條件)下生理學變化過程和生理學機制, 很少見在多物種或多細胞類型分隔或混合培養狀態下、或對天然生物群落進行轉錄組分析。但自然界不同物種之間廣泛存在相互作用, 且多以物種混合狀態出現，這也對傳統的RNA-seq提出了一定挑戰。

本文從兩物種(或細胞類型)的交互轉錄組分析(Dual RNA-seq)到多物種(或細胞類型)混合物種轉錄組分析(Mixed-species RNA-seq)介紹了轉錄組分析從單物種單細胞類型向混合物種、多細胞類型的發展趨勢, 以期為海洋生態學研究提供參考。

1 RNA-seq定量基因轉錄本豐度

確定細胞在不同生長階段和環境條件下的基因表達模式變化, 目前使用最廣泛的技術是轉錄組隨機測序(Whole transcriptome shotgun sequencing, RNA-seq)。RNA-seq是一種利用海量平行測序方法對轉錄組進行分析的技術, 可分析低豐度轉錄本, 容忍無參考基因組序列的分析, 相對微陣列雜交(Microarray hybridization)等, RNA-seq的轉錄本覆蓋度和分辨率更高, 價格更低, 已成為研究基因表達模式、代謝過程、生理機制等的首選技術。RNA-seq主要用二代測序平臺獲取和比較一個物種不同發育時期或不同生長條件或不同器官組織全部基因轉錄本豐度[2-3]。但轉錄組分析不限于二代測序技術。目前, 納米孔測序(因為直接基于DNA分子結構進行測序, 可理解成人眼通過儀器延伸直接閱讀DNA序列, 作者稱之為第四代海量平行測序技術)不僅可以獲得全部轉錄本的全長序列, 而且可以實現定量, 也就是同步獲得轉錄本豐度信息。

轉錄組測序有無參和有參兩種選擇。無參指沒有參考基因組序列, 不依賴已知基因列表, 先在二代測序平臺上獲得短讀序(Read), 然后從頭組裝成連續序列, 或稱Unigene, 就是對應不同轉錄本(包括轉錄后可變剪切產物)的也有可能是不完整的 cDNA序列。Unigene數量經常遠遠超過依據基因組序列預測的基因(Gene model)數量。轉錄組測序同時獲取轉錄本豐度(Abundance)信息。這樣的豐度信息經過正規化(主要是轉錄本長度差異)修正后, 同物種不同生長或發育時期、不同器官組織、不同環境、不同處理間可以相互比較, 提取豐度差異, 進一步根據功能分組或富集到不同的代謝途徑或信號通路, 輔助闡明生理學過程或生理機制。

隨著測序技術的不斷進步, 現在的納米孔測序, 不僅能獲得全長轉錄本序列, 而且能做到轉錄本豐度定量。只是成本比二代測序高一些。與無參轉錄組測序同時存在的, 還有有參轉錄組測序, 也就是二代獲得短reads之后, 不是從頭組裝, 而是根據序列同源性堆砌(Align/ map)到基于高質量參考基因組序列預測的基因(Gene model)上, 再根據基因長度修正, 獲得不同基因的轉錄本豐度信息。有參轉錄組分析需要高質量的參考基因組序列, 可以分析基因的可變剪切(Alternative splicing)等情況。遺憾的是, 很多非模式物種暫時沒有高質量參考基因組序列, 無法實現有參轉錄組分析。為在成本和探索需求間取得平衡, 作為替換手段之一, 可以先做全長轉錄組測序[4-7], 用全長轉錄本序列做參考, 再用二代測序進行轉錄組分析。盡管全長轉錄組測序可以混合生長發育時期、不同器官組織、不同處理條件的樣品, 盡可能多的覆蓋轉錄本序列, 但總有可能產生遺漏。用四代納米孔測序(因為連DNA聚合酶都不需要了, 作者稱其為四代測序, 以期與三代實時單分子測序區別)可以做到轉錄本豐度定量。這時候就無法顧及轉錄本類型覆蓋度了。目前, 一般的策略是依據參考基因組信息或全長轉錄組信息, 基于二代測序技術, 進行轉錄組測序分析。另外, 目前還有單細胞基因組(Single-cell genome sequencing)和轉錄組測序(Single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)[8-10]。盡管有基于微陣列(Microarray)和混合RNA測序(Bulk RNA-seq)的細胞群體轉錄組分析[11-12], 但從物種角度看, 這些分析或分析手段都是單一物種的比較分析。

作為一種發展趨勢, RNA-seq越來越多地用在多物種或多細胞類型的轉錄組測序分析上。表現在三個方面：(1)數據再分析。在這種情況下, 獨立分開獲得的數據被綜合再分析, 提煉出原分析無法提煉的認知[13-15]；(2)雙物種或細胞類型RNA-seq(Dual RNA-seq)；(3)多物種或細胞類型RNA-seq。這些都是研究物種間或細胞類型間互作的方法, 互作可以分為直接互作和間接互作。直接互作就是物種或細胞類型間可以接觸, 而間接互作就是物種或細胞類型是物理分隔培養的, 但共享培養環境。

2 共用培養環境的不同物種或細胞的分隔培養

共享培養環境(如培養基)的不同物種或不同細胞分隔培養可研究數量有限的物種或細胞類型間的相互作用[16]。不同物種或細胞類型的物理分隔可借助微流體系統(Microfluidic system)、膜(Membrane)、微液滴(Droplet)、培養皿(Petri dish system)、固體支持系統(Solid support system)、凝膠(Gel)、玻璃夾層(Glass slide)、分區生物反應器(Bioreactor system)、互通微池(Transwell system), 等[17]。不同物種或細胞類型與培養基之間可物理分隔, 但培養環境可共享, 培養基內物質可自由交流, 為所有物種或細胞類型共用, 但不能保證共享共用的效率一致。因材料和/或物質交流空間位阻限制, 可分隔培養的物種數或細胞類型數是極其有限的[18]。Thermo Scientific公司甚至專門設計了適用不同細胞類型分隔培養的插管和載板(Nunc cell culture inserts and carrier plates)。有了這樣的培養體系, 物種間或細胞間的互作就能發生并能被檢測到。不同物種或細胞類型的共培養分直接(Direct)共培養和間接(Indirect)共培養[19]。現在的趨勢是增加直接共培養的物種數或細胞類型數, 基于數據處理實現物種或細胞類型分隔, 而不是物種和細胞類型的物理分隔。隨著測序技術的進步, 物種或細胞的物理分隔培養現在已經越來越少了。

3 兩物種或細胞類型混合轉錄組分析(交互轉錄組分析, dual RNA-seq)

物種在自然界中從來都不是徹底獨立存在的。穩定生態系統存在諸多物種, 物種間存在復雜相互作用。僅考慮兩物種間相互作用, 基于利害就可以將兩物種間相互作用分為競爭(對雙方均有害)、互利共生(對雙方均有利)、偏利共生(對一方有利, 對另一方無影響)和寄生(對一方有利, 對另一方有害)等四類。物種間相互作用往往表現在生理生化層面, 有時也表現在基因層面。例如, 相互作用一方的分泌物或其本身被另一方細胞表面受體識別, 引發另一方的信號傳遞級聯反應, 觸發或停止轉錄調節因子, 改變相關基因轉錄本豐度, 進而改變其行為和代謝過程[1]。用交互轉錄組測序研究的重要生物學問題包括：病原-宿主侵染關系、寄生關系和互利共生關系等。病毒、細菌、真菌、原生動物等都可作為病原侵染真核生物細胞, 侵染過程影響雙方的基因表達模式和生理生化過程。互作轉錄組可同時監測雙方分子水平的交互變化[20]。該方法最早用于細菌感染人體的研究中。例如：在白色念珠球菌(Candidaalbicans)侵染人體肌肉細胞, 互作轉錄組分析甄別出存在關聯變化的基因調控模式[21]。

交互轉錄組分析用于寄生關系研究, 涉及的物種組合包括真菌-植物、真菌-動物、細菌-動物、寄生蟲-動、病毒-植物、病毒-動物等(見表1)。寄生關系往往發生在兩個親緣關系差異巨大的物種之間, 它們的細胞結構、翻譯過程中RNA的含量和組成迥然不同。作為宿主的真核細胞每個含有10～20 pg的RNA, 這大致是單個細菌細胞含量的100～200倍。但在真正感染過程中, 一個真核細胞往往有可能被十倍于其細胞數目的不同種類的病原侵入, 這也可將雙方RNA含量的差距縮小到10～20倍。除此之外, 真核細胞所含有的snRNA、snoRNA、scaRNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA、lincRNA和mRNA共同占了RNA總量的5%, 而細菌細胞的mRNA則獨占了其總量的5%[20]。基于這些特點, 在提取RNA時為了做到能兼顧二者的提取效率, 在普遍用TRlzol作為抽提溶劑的基礎上還可選擇均質儀、玻璃珠或利用相關溶解酶、緩沖液、超聲(革蘭氏陽性細菌適用)來增強病原體一方的破壁效果[38], 并結合MICROBEnrich試劑盒或Poly(A) Purist Mag方法來富集其轉錄豐度[39]。其次, 在比對時可根據實際情況選擇將二者的參考基因組分開還是整合到一個文件內進行比對, 并根據其各自的差異特點設置合適的比對參數, 交叉匹配的序列情況可以作為比對質量的參考[40]。在實施時, 細菌真核細胞混合所測序列可首先利用HISAT2、MapSplice、STAR、Tophat2中的一種軟件來分離隸屬于真核宿主細胞的序列, 然后再將余下的序列通過Bowtie2、SEAL、SOAP2軟件中的一種進行屬于細菌序列的識別[38,41]。還可使用RNA CoMPASS這樣一款近年發明的對用戶友好的算法平臺來進行全過程的比對[42]。Dual RNA-seq在寄生領域將會被應用到探討宿主與更多種類病原體共存關系的情況中。根據實驗目的和要求的不同還可與Single cell RNA-seq結合來解決被感染宿主細胞所占比例少, 同一組織樣本中細胞類型不同、感染階段不同步等傳統RNA-seq所遺留的問題[39]。研究人員在沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)感染小鼠巨噬細胞的實驗中就首次采用了這種手段從而提出了一個包含3個階段的感染過程模型[43]。

表1 用交互轉錄組分析方法研究過的部分種及寄生關系信息

自然生態系統中也普遍存在互利共生關系。目前, 人們用dual RNA-seq闡明或豐富了這些物種之間長期自然選擇形成的共生策略, 共生機制涉及物質交換、環境資源分工利用等。最早嘗試使用dual RNA-seq進行共生關系研究的是兩種同屬細菌,Treponemaprimitia和T.azotonutricium。它們是白蟻腸道菌群中的兩種細菌, 將白蟻攝入的木質纖維素分解為二氧化碳、醋酸、氨基酸、維生素等一系列生存必需物質。已知這兩種細菌之一給另一種提供氫氣。交互轉錄組分析發現雙方在維生素B6、B7及一種輔酶A的合成利用上也存在合作[44]。小麥和根瘤固氮菌是典型的互利共生關系。一種固氮菌(Azospirillumbrasilense)和小麥(Triticumaestivum)的dual RNA-seq發現固氮菌促進小麥生長的機理。一種類似NarL的蛋白使固氮菌吸附到小麥根部, 固氮菌上調硝酸鹽及一些營養物質轉運體基因的表達, 同時提高小麥根部細胞DNA復制及細胞分裂能力, 促進小麥根發育。另外, 固氮菌下調乙烯及類黃酮物質合成有關基因的表達, 提高小麥抵抗環境脅迫的能力[45]。有一種罕見的蠑螈(Ambystomamaculatum), 其受精卵細胞和一種綠藻(Oophilaamblystomatis)共生。綠藻吸收受精卵內豐富的磷酸鹽和谷氨酰胺, 同時為受精卵提供氧氣、有機酸、脂肪酸等, 影響受精卵運輸外界營養物質, 降低胞內糖分消耗[46]。

4 混合物種轉錄組分析(Mixed-species RNA-seq, msRNA-seq)

生態系統中物種互作涉及眾多物種, 十分復雜[47]。為用轉錄組測序方法研究多物種相互作用, 人們提出了混合物種轉錄組測序(Mixed-species RNA-seq)策略[48]。共培養(Co-culture)或共存不同物種(包括不同細胞類型)混合轉錄組測序不需要物種隔離。它用數據處理方式將混合數據分配給不同物種, 實現信息層面的物種分離(insilicoRNA-seq read sorting)。能做到信息層面物種分離是因為mRNA的進化趨異(Evolutionary divergence), 也就是進化過程中產生的基因有無和基因序列差異等變化。作為例子, 該方法已用在人初級星形膠質細胞(Human primary astrocyte-鼠胚胎(Mouse embryo)-倉鼠幼崽(Rat pup)體細胞[48]、人-鼠心肌神經元細胞(Cortical neuron)[49-50]、人-鼠血小板細胞(Platelet)[51]的混合轉錄組測序上。醫學研究方法總是走在前面的, 混合物種轉錄組測序也不例外。除了不同細胞類型, 該方法也開始用于被子植物[52]和藻[53]等生物類型的混合物種轉錄組分析上。作者相信, 混合物種轉錄組測序完全可以克服不同物種分離或物理分隔的方法限制和不利因素, 實現從數據角度剖分物種, 一定能用于海洋生態學和實驗海洋生態學研究, 剖析物種間的互作關系, 廓清眾多海洋生態學的關鍵問題。混合物種轉錄組測序(mixed-species RNA sequencing, msRNA-seq)一定能在海洋生態學研究中發揮其獨特作用。

混合物種轉錄組測序方法的形成不是一蹴而就的。測序技術的進步為該方法提供了存在的條件。兩物種交互轉錄組測序(Dual RNA-seq)是該方法的最約減形式, 在宿主-病原菌互作機制等研究上已發揮了重要作用。RNA-seq一般分析單一物種的轉錄本。當分析兩物種或多物種的轉錄本及其豐度變化時, 傳統的RNA-seq就不得不在提取RNA前就將這些物種分離。對那些能分離的物種, 需要前期工作, 也必然會帶來污染或基因表達變化等影響。更多的情況是物種無法分離。交互轉錄組(dual RNA-seq)在數據處理階段拆分物種, 很好地解決了這些問題[2]。

msRNA-seq形成的讀序來源兩種或兩種以上的物種或細胞類型。Hasel[50]研發了一個搜尋和分配程序(Sargasso: Sargasso Assigns Reads to Genomes According to Species-Specific Origin)(http://doi.org/10.5281/zenodo.206619)，依據物種或細胞類型搜尋和分配讀序將讀序分配到不同的物種或細胞類型。目前，轉錄組測序多走商業測序途徑。不論使用什么工具進行分析，分析的策略都應該是先依據同源序列在不同物種或不同物種細胞之間的進化趨異特點將讀序先分配到不同的物種或細胞類型中，然后與對照比較轉錄組差異，解析生理學機制。這樣做，可以克服因細胞比例不同而導致的基因轉錄本豐度過低的問題。不論細胞比率，轉錄組分析獲得的讀序數量都應該滿足飽和程度的要求。研發這一工具的時候，用的只是兩類細胞。但隨著擬研究問題越來越深入，需要做msRNA-seq的物種或細胞類型越來越多。為此，Qiu[48]專門寫就了一個msRNA-seq的標準實驗程序。

5 msRNA-seq在海洋生態學中的應用前景

5.1 有害藻類過度繁盛及群落演替機制研究

有害藻類過度繁盛(Harmful algal blooms, HABs)發生頻率不斷增加, 其環境影響越來越嚴重, 已成為海洋主要生態問題之一。在自然生態環境中，硅藻和甲藻間存在強烈競爭[54]。硅/甲藻指數(Diatom/Dinoflagellate index)經常用來指示環境變化[55]，如氣候變暖等[56]。硅藻和甲藻用不同的機制響應環境變化[57]。硅藻和甲藻的競爭還表現在形態、生理甚至分子層面[58]。中國長江口海域2000年以前主要是硅藻(如Skeletonemacostatum)引起HAB[59]。之后, 甲藻(如Prorocentrumdonghaiense、Kareniamikimotoi)等逐漸取代硅藻成為引起HAB的主要藻類。目前,硅藻-甲藻演替機制研究主要圍繞環境因子(如營養鹽、溫度、光照、甲藻有毒化感物質等), 而在轉錄組層面研究硅-甲藻競爭機制很少。僅有的報道也是先混合培養，然后分隔兩物種藻種細胞再做RNA-seq，解析硅-甲藻互作生理機制[58]。在數據處理過程中而不是在培養階段分隔硅藻甲藻，解析它們互作分子機制時，不得不面對的主要問題是具有參考基因組序列同時也是海洋環境(或擬研究；或被關注)過程關鍵參與者的物種很少。到目前為止，有基因組序列的只有三角褐指藻[60]和海鏈藻[61]，而具有基因組序列的甲藻只有珊瑚共生甲藻[62-63]。這些共生甲藻基因組能被測序，最主要原因是它們的基因組較小(1 Gb左右)。與此形成鮮明對照，一些自由生活甲藻的基因組十分巨大，最多接近200 Gb。用現有技術測定這些甲藻的基因組序列仍然是巨大的挑戰。當然，這些巨大基因組可能存在暫時還沒有被理解的特殊結構，也許通過適當的人工調整，這些基因組也能很快被測定。但是，至少到目前為止，甲藻參考基因組序列缺乏對用msRNA-seq解析硅-甲藻互作機理還是一個限制。克服的方法也是有的，比如全長轉錄組分析獲得的轉錄本序列就能用作msRNA-seq的參考基因序列。

在技術方面，目前已經有方法將特定藻或動物細胞從群體中分離出來，再結合單細胞組學分析方法，可以研究不同物種(或細胞類型)互作機制。作為例子，單細胞分選方法有基于核酸適配體的微流體裝置(Aptamer-based microfluidic device)[65]、熒光激活細胞分選(Fluorescence-activated cell sorting)[66]、拉曼激活細胞分選(Raman-activated cell sorting, RACS)[67]、拉曼激活細胞分選和測序(Raman-activated cell sorting and sequencing, RACS-SEQ)(https://phys.org/news/2018-11-china-world-instrument-raman-activated-cell.html)等。值得稱道的是，中國科學家在這個領域已經領跑世界，RACS、RACS-SEQ設備和技術就是中國科學家研發的。雖然細胞分選技術、單細胞分選和單細胞測序技術組合有望解析不同藻類或不同細胞類型的互作機制。物種的表現型是眾多細胞的集體的表現型，了解單細胞表現型的同時，無法描述物種群體的表現型。因此，單細胞分選和測序技術形成了一個技術極端。現代方法和技術能用于探索新問題，但如何與傳統認知融合尚待深入探索。

中國科學家還在探索另一個方法學極端，就是直接針對浮游植物群體做組學分析，解析硅藻-甲藻在自然群體中的演替規律，即所謂宏組學(Metaomics)研究。例如，Zhang[68]進行天然浮游植物集合時間序列宏轉錄組分析(Time sequential metatranscriptomic profiling)，測定宏轉錄組，解析群體生理學過程演變，通過將硅需求、尿素信號途徑歸于硅藻而將磷需求、細胞自噬營養循環等歸于甲藻，基于群體生理學過程演變解析硅藻-甲藻演替機制。這是另一個技術極端，雖然回避了單細胞分選，但也無法精確到物種進行機制解析。更極端的探索是直接進行蛋白組分析來解析細菌-甲藻在HAB過程中互作機制[69]。同樣，這樣的嘗試無法基于具體物種解析機制。作者有理由相信, 混合物種RNA-seq將能結合不同方法的優勢，克服不同方法的限制，給硅藻-甲藻競爭機制和環境中各種復雜互作機制研究帶來新的生機和活力。

5.2 微藻規模化養殖效益和敵害生物控制研究

不同物種互作研究是合成生態學(Synthetic ecology)研究內容之一, 即人為構建多物種共培養系統或直接針對自然群體, 闡明不同物種間的相互作用、提高特定物種培養效率或建立物種間新型互作關系[17], 在醫學、工業生產、環境等方面有廣闊的應用前景。農作物中，不同水稻品種規模化分塊混合栽培可以有效防止病蟲害。可以預期的是適當組合的微藻、微藻-細菌混合養殖甚至適當的微藻與浮游動物組合有可能提高微藻養殖效率。例如，產油微藻的室內生長和油脂合成條件不適用規模工業化生產, 而室外單微藻種養殖經常受敵害生物(原生動物、雜藻、細菌等微生物)影響。基于細致的研究, 人為構建產油微藻的合成群落(Synthetic community), 讓目標藻、共生菌、伴生生物營養互補, 抑制敵害生物繁殖, 就可以提高產油微藻培養效率, 促進產油微藻大規模養殖[70]。

5.3 與珊瑚礁白化現象有關的藻-珊瑚蟲共生機制研究

擁有著廣泛生物多樣性和較高初級生產力的珊瑚礁生態系統是整個海洋生態系統的一個極為重要的組成部分。而造礁的珊瑚蟲對自身的生存環境要求極為嚴格：鹽度、溫度和營養物質等因素都必須要穩定在一個特定的范圍內。當周平均溫度的浮動范圍在超過一度后，就會破壞其與胞內蟲黃藻的互利共生關系，造成珊瑚礁的“白化”現象[71]。因此，揭示蟲黃藻屬與珊瑚蟲的共生及其對外界環境的響應機制是解決近些年來世界范圍內珊瑚礁大規模白化現象爆發的關鍵。

運用Dual RNA-seq的思想，有日本研究學者對從沖繩附近海域采集到的一種珊瑚蟲(Acroporatenuis)及可附生在其上并進行良好繁殖的蟲黃藻屬中的一種Symbiodiniumtrenchi的早期共生建立過程進行了分子水平上的初步探索。結果顯示，蟲黃藻在入侵過程中其自身的miRNA出現了過表達的趨勢，而珊瑚蟲細胞內與胞吞作用有關的基因也相應呈現上調狀態，與之相反的是與免疫作用及消化酶有關的基因則處于下調狀態。并且，兩者還在糖類、谷氨酸等相關蛋白質的代謝及縮醛磷脂的合成方面有密切聯系[72]。

5.4 海洋生態系統中重要的寄生關系研究

如前文表格中所示的病毒、真菌、細菌、原生動物等寄生類群在海洋生態系統中也發揮著重要的作用。有研究對太平洋三個河口營寄生和自由生活的動物類群的生物量和生產力進行了定量分析發現寄生動物類群的生物量甚至超過了處于食物鏈頂級的肉食動物。它們可以通過影響中間宿主的行為來選擇性的促進捕食者與被捕食者的關系并通過食物鏈的傳遞來作用于整個食物網的拓撲結構[73]。海洋生態系統中的寄生關系主要應用于利用寄生動物作為生物標記來判斷不同經濟魚群以及作為病原體所引發的海水養殖品種的病害防治方面[74]。而對于后者，尤以病毒成為一個日益活躍的成病原因。養殖品種疾病爆發原因復雜，同一寄主在宿主的幼體期及成體期也有著不同的表現情況[75]，這其中還有太多未識別的病原種類及寄生作用機制亟待msRNA-seq的加入來填補研究空白。用一句話概括，只要是涉及物種間相互作用機制的研究都可以使用msRNA-seq方法。

6 結語

轉錄組測序只是一種手段。已普遍的二代測序、正在推廣的四代納米孔測序是工具和技術的推陳出新, 標志成本的快速降低和效率的不斷提高, 但如何應用這種手段來解決海洋生態學領域多種多樣的復雜棘手問題還需要研究設計的創新。交互轉錄組(Dual RNA-seq)、混合物種轉錄組(Mixed species RNA-seq)、單細胞轉錄組(Single cell RNA-seq)[76]及顯微鏡下可觀測的細胞轉錄組(空間轉錄組)(Spatial transcriptomics)[77]等提供了越來越多、越來越靈敏的轉錄組分析手段, 利用好這些手段, 解決好海洋生態學問題是海洋生態學研究者需要積極探索的研究領域。研究手段現代化和研究思路新穎化必將為海洋生態學研究提供新的生機與活力。

單細胞測序(Single cell sequencing)基于海量平行測序(即所謂下一代測序)獲取單個細胞的序列信息，分單細胞基因組測序和單細胞轉錄組測序，為更好地解析細胞間差異、更徹底地理解處于微環境中不同細胞的功能提供了可能[78-79]。單細胞基因組測序包括單細胞分離、全基因組擴增、測序文庫構建、基于海量平行測序技術測序等步驟。以這樣的方式獲得的基因組一般稱為單細胞擴增基因組(Single amplified genome, SAG)。單細胞轉錄組測序包括單細胞分離、裂解、逆轉錄、cDNA擴增和用RNA-seq定量轉錄本豐度等步驟。在結語中重提單細胞測序，有兩個原因：(1)盡管目前存在各種技術挑戰，單細胞測序基于單細胞基因組和轉錄組信息解析群體中不同細胞的變異和生理狀態；(2)為不同物種提供參考基因組或轉錄本參考序列。單細胞測序技術具有認知單個細胞遺傳變異和生理行為的潛力，但物種總是表現為細胞(個體)的群體行為，物種競爭和互作是細胞群體間的競爭和互作。當數據量足夠大(飽和)的時，只要將數據分配到不同的物種或不同物種的細胞，就能解析細胞群體表現進而理解物種互作和競爭。單細胞測序是現在的研究熱點，但它面臨各種技術挑戰。用該技術獲得所有物種參考序列可行性仍然不高。例如，甲藻基因組大小變化巨大， 有些甲藻基因組達200 Gb左右。目前基于細胞群體的基因組測序技術尚且拿這么大的基因組沒辦法，何況單細胞測序技術。因此，在相當長的時間里，仍將不得不在實驗生態系統中用msRNA-seq研究有基因組或者全長轉錄組序列的物種間的互作和競爭機制。

另外，生理學機制也包括次生代謝產物合成的變化和次生代謝物質在細胞間的轉運、識別和響應[80]。盡管這些變化可以在轉錄組層面反映出來，但細胞內、細胞外的代謝物組成和變化分析是深入認知物種互作和競爭的重要信息。在生理學層面解析物種互作和競爭機制的同時，理應分析細胞內外次生代謝物質的組成和動態變化。