銀靈康膠囊的提取工藝研究

1.長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031；2.綠葉集團北大維信生物制藥公司，遼寧 沈陽 110016

銀屑病是一種常見的紅斑鱗屑性皮膚病,俗稱“牛皮癬”,相當于中醫學中的“白”,其纏綿難愈、易于復發。西醫學認為,其發病與遺傳、感染、代謝障礙、內分泌失調、神經精神因素及免疫紊亂等多方面因素有關，目前尚無理想療法。中醫藥治療此病療效確定，且具有延長緩解期、副作用小的特點[1]。銀靈康膠囊在治療銀屑病方面有著顯著的療效。銀靈康膠囊由金銀花、土茯苓、青黛、白鮮皮、牡丹皮、生石膏六味藥材組成的中藥復方，具有清熱解毒、涼血、滋陰潤燥、養血祛風之功效[2]。主治尋常型銀屑病，以及愈后的預防和鞏固治療。本方中金銀花和土茯苓均具有殺菌、抗炎、提高免疫力的作用。本實驗參照中藥、天然藥物制劑研究的技術指導原則，優化金銀花和土茯苓的提取工藝。采用單因素法，以綠原酸和落新婦苷含量為指標，考察提取溶劑種類、提取方法、提取次數等因素對提取效率的影響。設計正交試驗，以綠原酸和落新婦苷含量作為綜合評分指標，確定最佳提取工藝。為研究療效更確切，質量穩定的銀靈康膠囊奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 JASCO高效液相色譜儀(日本分光公司)；UV-2075型紫外可見光檢測器(日本分光公司)；Sepu3000色譜工作站(山東金普分析儀器有限公司)；AT-130柱溫箱(上海理達儀器廠)；BS110S型電子天平(德國Sartorius公司)；PHS-3BW精密數顯酸度計(上海理達儀器廠)；KH-250DE型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；JP-A型架盤天平(上海一恒科學儀器有限公司)；恒溫水浴鍋HH-Z(國華電器有限公司)；真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 材料 綠原酸對照品(批號：1110753-200413)、落新婦苷對照品(批號：111798-201102)購于中國藥品生物制品檢定所，甲醇(批號：20180525)、無水乙醇(批號：20180418)、丙酮(批號：20180306)都為分析純，購于山東禹王實業有限公司化工分公司，乙腈為色譜純(批號：20180-309)購于山東禹王實業有限公司化工分公司，微晶纖維素(批號：171104A鄭州浩力化工有限公司)、重蒸水(自制)。

金銀花、土茯苓、白鮮皮、牡丹皮、青黛等藥材均購自安國市神禾中藥材飲片有限責任公司，經遼寧中醫藥大學李少寧副教授鑒定，符合2015年版《中國藥典》藥材項下規定。

2 方法與結果

2.1 綠原酸和落新婦苷含量測定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 混合對照品儲備液 取綠原酸、落新婦苷對照品適量，精密稱定，分別置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為2.40 mg/mL和0.110 mg/mL的對照品儲備液。精密量取綠原酸對照品儲備液2 mL、落新婦苷對照品儲備液2.5 mL，置于同一50 mL棕色量瓶中，用體積分數50%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得到混合對照品儲備液。

2.1.1.2 供試品溶液 取樣品干浸膏約2.0 g，精密稱定，研細，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率220 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定質量，用無水乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加體積分數50%甲醇水溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.1.1.3 陰性對照溶 液按處方比例制備除金銀花、土茯苓外的陰性樣品，按“2.2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流動相：乙腈 (A)-體積分數0.05%磷酸溶液(B)；梯度洗脫，程序見表1；柱溫：30 ℃；檢測波長：291 nm；流速1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫

2.1.3 系統適用性試驗 取供試品溶液，在上述色譜條件下進樣，理論塔板數按綠原酸峰計算不低于 5000。供試溶液中綠原酸、落新婦苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對照對測定無干擾。色譜圖如圖1所示。

2.1.4 線性關系考察 精密量取混合對照儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置10 mL棕色量瓶中，用體積分數50%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照溶液。在上述色譜條件下進樣，記錄峰面積。以質量濃度(ρμg/mL)為橫坐標，以峰面積(A)為縱坐標，進行線性回歸。綠原酸、落新婦苷回歸方程分別為A=2.961×104ρ-2.375×104，(r=0.999 9)和A=6.757×104ρ+1.423×103(r=0.999 5)。結果表明，綠原酸、落新婦苷質量濃度分別在9.60～96.0 μg·mL-1和0.55～5.50 μg/mL內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取混合對照溶液(綠原酸、落新婦苷的質量濃度分別為38.4、2.20 μg/mL)，在上述色譜條件下重復進樣6次，計算綠原酸、落新婦苷峰面積的RSD分別為1.4%、2.2%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 精密稱取同一批樣品6份，按“2.2.1.2”項方法制備供試溶液，在上述色譜條件下分析，以外標法計算綠原酸、落新婦苷含量的RSD分別為2.0%(n=6)、2.6%(n=6)。表明方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.2.6”項下重復性試驗的同一供試溶液，室溫放置。在上述色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析。計算綠原酸、落新婦苷峰面積的RSD分別為2.5%、2.1%。表明供試品溶液室溫放置至少在12 h內穩定。

2.1.8 回收率試驗 精密稱取已測定含量的樣品約1.0 g，共9份。分別精密加入質量濃度為2.40 mg/mL綠原酸對照儲備液1、2、3 mL，質量濃度為0.110 mg/mL落新婦苷對照儲備液1.6、3.3、4.8 mL(制備低、中、高3個質量濃度的樣品，n=3)，按“2.2.1.2”項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算回收率，結果見表2。

表2 銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷回收率試驗結果 (n=9)

2.2 單因素試驗

2.2.1 考察因素

2.2.1.1 提取溶劑考察 綠原酸是一種極性較強的分子，落新婦苷是一種中等極性的分子，都易溶于醇和丙酮，所以本實驗考察了不同濃度的乙醇，甲醇，丙酮和水作為提取溶劑對綠原酸和落新婦苷提取效果的影響。

2.2.1.2 提取溫度考察 在預實驗及相關文獻基礎上[3]，提取過程中溫度過低，不利于綠原酸的溶出；溫度過高，又易引起綠原酸的降解。故本實驗在50～90℃范圍內研究溫度對提取的影響。考察的溫度分別為50、60、70、80、90℃，料液比為1∶10，提取時間2 h，提取2次，用90%乙醇進行回流提取。

2.2.1.3 提取時間考察 根據預實驗及相關文獻[4-5]適當的延長提取時間，能夠提高綠原酸和落新婦苷的得率，但是如果提取時間過長，不但不能提高綠原酸和落新婦苷的得率，反而會使樣品降解，增加提取液中雜質的含量。所以本實驗在料液比為1∶10，提取溫度為80℃，提取次數2次前提下，采用0.5、1、1.5、2、2.5、3 h為提取時間，用90%的乙醇回流提取。

2.2.1.4 料液比考察 一般來說，溶劑過少，溶液容易飽和，其有效成分不能提取完全；溶劑過多，雖然提取較完全，但是給下一步濃縮操作帶來不便，而且浪費能源。本實驗在上述實驗確定提取溫度80℃，提取時間2 h前提下，分別以1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20的料液比進行考察。

2.2.1.5 提取次數考察 在上述實驗確定了提取時間2 h，提取溫度80℃，料液比1∶10的基礎上，對樣品不同提取次數(1、2、3、4 次)進行考察。

2.2.1.6 浸泡時間考察 按單因素分析所得出的優化條件(即乙醇濃度90%,提取時間2 h,溫度80℃，提取次數2次)分別考察浸泡0.5、1、1.5、2 h對樣品提取率的影響。

2.2.2 提取溶劑選擇 參考文獻報道[6-7]，實驗考察80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮和水對提取效率的影響。從圖2可知，用80%乙醇和80%甲醇提取時綠原酸的得率差別不大；落新婦苷的得率在80%乙醇中是最高的，且乙醇的毒性小于甲醇的毒性。故本實驗選擇乙醇為提取溶劑。

2.2.3 乙醇比例的選擇 乙醇濃度對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸得率增加，且在乙醇濃度90%時最高，然后降低；落新婦苷得率在乙醇濃度95%時最高。綜合分析，因此，本實驗最終選擇90%乙醇作為提取溶劑。

2.2.4 提取溫度選擇 實驗考察了不同提取溫度對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖4 可知，隨著溫度增加，綠原酸含量在80 ℃時達到峰值，之后隨著溫度增加而下降；落新婦苷含量也在溫度80 ℃時最高值，之后迅速下降。因此，將本實驗的提取溫度定為80 ℃。

2.2.5 提取時間選擇 考察不同提取時間對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖5可知，隨著提取時間增加，綠原酸得率緩慢增加，在提取時間為2 h時達到峰值，然后又緩慢下降；落新婦苷得率在提取時間為2 h時最高值，而后下降至平緩。因此，本實驗采用提取時間為2 h。

2.2.6 料液比選擇 考察不同的料液比對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖6可知，隨著料液比增加，綠原酸得率也有所增加，但是幅度不大，在1∶15時出現一個峰值，然后略有下降；落新婦苷得率在1∶10時出現峰值，之后下降趨于平穩。因此，本實驗選擇料液比為1∶10。

2.2.7 提取次數選擇 考察不同的提取次數對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖7可知，綠原酸得率在提取次數為2次時達到峰值，之后隨著提取次數的增加，綠原酸得率下降；落新婦苷得率同樣在提取次數為2次時最高，之后迅速下降。綜上分析，本實驗選擇提取次數為2次。

2.2.8 浸泡時間選擇 考察不同的浸泡時間對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖8可知，浸泡1.5h時，綠原酸和落新婦苷得率最高。因此，選擇浸泡時間為1.5h。

2.2.9 提取方法選擇 對超聲法和回流法進行比較，從圖9可知，回流法的提取效率高于超聲法提取效率。故本實驗選擇回流法提取。

2.3 正交試驗

2.3.1 樣品提取物的制備 按處方比例稱取金銀花、土茯苓、白鮮皮、牡丹皮藥材適量，采用乙醇回流提取，提取液過濾，置于干燥至恒重的蒸發皿中，濃縮至相對密度為1.25～1.28(80℃)的稠膏，加入生石膏、青黛粉，充分混勻，60 ℃下減壓干燥(24 h)，得到初提物。以不同提取溶劑，不同提取次數，不同提取時間，不同料液比，不同浸泡時間，不同乙醇濃度，溫度，不同提取方法(超聲或回流)進行單因素試驗，然后以單因素試驗結果設計四因素三水平的正交試驗，對銀靈康膠囊中的金銀花和土茯苓提取工藝進行優化。

2.3.2 因素水平設計 為了進一步優化銀靈康膠囊提取工藝，根據以上單因素實驗結果并參考文獻，本實驗選取對銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取率影響較大的4個因素：提取時間(A，1.5、2、2.5 h)，提取次數(B，1、2、3次)，提取溶劑(C，85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇)，料液比(D，1∶8、1∶10、1∶12)，進行L9(34)正交試驗。以獲得這些因素對綠原酸和落新婦苷提取率影響的變化趨勢,并考察各因素對提取率影響的主次順序。因素水平見表3，正交試驗安排見表4。

表3 因素水平設計方案

表4 正交試驗安排

續表4

表4 正交試驗安排

2.3.3 試驗結果 采用綜合評分法[8]，以綠原酸的權重系數為0.6，落新婦苷的權重系數為0.4進行綜合評分。綜合評分分數=(綠原酸/綠原酸最大值×綠原酸的權重系數+落新婦苷/落新婦苷最大值×落新婦苷的權重系數)×100。其中綠原酸/綠原酸最大值表示每一實驗測得的綠原酸含量與9次測定的最高含量比值；落新婦苷/落新婦苷表示最大值每一實驗測得的落新婦苷含量與9次測定的最高含量比值。正交試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 正交試驗結果

表6 方差分析結果

從直觀分析可知，各因素對綠原酸和落新婦苷提取率的影響順序為：A>B>D>C。以極差最小的C因素為誤差，進行方差分析可知，A，B，D因素對提取率都有顯著影響，僅C因素對提取率無顯著影響。因素A有顯著性差異，且A2>A3>A1，故選擇A2；因素B有顯著性差異，且B3>B2>B1，應該選擇B3，但從極差的均值看水平B2和B3相接近，從節省時間的角度考慮，選擇B2；因素D也有顯著性差異，且D1>D2>D3，故選擇D1。C無顯著性差異，且C2>C1>C3，結合單因素試驗，選擇C2。最后確定最佳工藝為：A2B2C2D1，即以10倍量85%乙醇，水浴回流提取2次，提取時間為2 h。

2.3.4 驗證實驗 按處方比例稱取各藥材3份，以最終確定的提取工藝A2B2C2D1，進行驗證，按照“2.1”項下方法測定綠原酸和落新婦苷的含量，取平均值測得綠原酸的提取率為12.4 mg/g，落新婦苷的提取率為0.686 mg/g，該方法重現性好，故認為該工藝穩定可靠。驗證結果見表7。

表7 驗證結果

3 討論

3.1 指標性成分的選擇 銀靈康膠囊由金銀花﹑土茯苓﹑青黛﹑白鮮皮、牡丹皮、生石膏6味藥材組成。金銀花為方中君藥，藥典中金銀花含量測定的指標性成分為綠原酸和木犀草苷；另一君藥土茯苓中的指標性成分為落新婦苷；青黛為臣藥，指標性成分為靛藍和靛玉紅；白鮮皮和牡丹皮為佐藥，指標性成分分別為梣酮、黃柏酮和丹皮酚。在制備工藝中，青黛和生石膏是不經提取加入的，不必考察其指標性成分的提取效率；金銀花中木犀草苷、白鮮皮中梣酮和黃柏酮含量偏低，而牡丹皮中的丹皮酚又難于測到。因此，本實驗選擇綠原酸和落新婦苷為指標性成分，優化了提取工藝。

3.2 權重系數的選擇 現代研究證明，綠原酸具有清除自由基、抗誘變抗癌、降脂、抗炎和免疫調節等作用；落新婦苷則具有抗炎、免疫，抑制利尿和鎮痛等作用。由于銀屑病是一種與免疫相關的疾病，對免疫系統有調節作用的化合物均與治療相關，有助于緩解癥狀。雖然綠原酸和落新婦苷都與治療相關，但各自所起得作用并非完全一樣，綠原酸主要以抗炎為主，落新婦苷抗炎和免疫調節作用相當。根據預實驗可知，綠原酸的含量較高，而落新婦苷的含量較低，為了更加體現其他有效成分作用并結合相關文獻報道[9]，綠原酸的權重系數為0.6，落新婦苷的權重系數為0.4。以2種指標成分確定最佳提取工藝可以為后續試驗提供依據。

3.3 提取工藝的選擇 實驗中以銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷的含量為指標進行工藝評價，根據單因素考察和正交試驗確定了銀靈康膠囊的提取工藝：金銀花、土茯苓等按處方配比稱取藥材(除生石膏、青黛外)，以10倍量85%乙醇為溶劑，水浴回流提取2次，提取時間為2 h，合并2次濾液，濾液濃縮至相對密度為1.25～1.28(80 ℃)的稠膏。加入生石膏、青黛粉。60 ℃下減壓干燥(24 h)，得到初提物。將初提物粉碎，得到干浸膏粉末。將干浸膏粉和微晶纖維素按比例(干浸膏∶微晶纖維素=20∶1(w/w))混勻，裝1號膠囊，即得。規格：0.5 g/粒。通過工藝驗證，證明使用優化的提取工藝，綠原酸和落新婦苷的提取效率大大提高。適合實際生產，可作為后續研究的基礎和參考。