HPLC法測定清咽利喉合劑中黃芩苷的含量

1.云南省執業藥師注冊中心，云南 昆明 650000； 2.云南省曲靖市第一人民醫院，云南 曲靖 655000； 3.云南健測檢驗檢測技術有限公司，云南 曲靖 655000

清咽利喉合劑是曲靖市第一人民醫院研制的院內制劑。由黃芩、金蕎麥、玄參、麥冬等組成，具有養陰、清咽、清熱解毒的功效，臨床用于咽喉腫痛、急性扁桃體炎、咽頰炎、上呼吸道感染等癥。其中黃芩為制劑中的君藥，有著悠久的應用歷史，始載于《神農本草經》，為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]?！侗静菡分杏涊d：“枯者清上焦之火，消痰利氣，定喘咳……，解瘟疫，清咽，療肺萎……”，臨床上主要用于肺熱咳嗽、癰腫瘡毒，咽喉腫痛等癥。黃芩苷是從黃芩中提取分離出來的一種黃酮類化合物，已證明有廣泛的藥理活性，具有消炎、解熱、抗病毒、抗菌等作用[1-2]。2015版《中國藥典》將黃芩苷作為黃芩的質量控制指標[3]。結合《中國藥典》和文獻[4-8]，通過對清咽利喉合劑中君藥黃芩的有效成分黃芩苷進行含量測定，從而達到對該藥的質量控制。實驗采用高效液相色譜法測定清咽利喉合劑中黃芩苷含量，操作簡單，準確性高，為有效控制清咽利喉合劑質量提供可靠且簡便易行的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(包括高壓四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站)；超聲波清洗器(上海聲源超聲波清洗器設備有限公司)；ME104萬分之一電子分析天平、ME55十萬分之一電子分析天平。

1.2 材料 黃芩苷對照品(批號：110715-201318，中國食品藥品檢定研究院，含量為93.3%)；清咽利喉合劑(批號：20190127-1、20190326-2、2019012-2，曲靖市第一人民醫院制劑室)，甲醇(分析純，批號：127848，賽默飛世爾科技有限公司)，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品 1.55 mg，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成濃度為0.05785 mg/mL 對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取清咽利喉合劑2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加50%乙醇35 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取此液5.0 mL，置25 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按清咽利喉合劑的處方比例，分別稱取除黃芩以外的其他藥材，依照清咽利喉合劑工藝制備不含黃芩的陰性樣品，并按“2.1.2”項下制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(32∶68)，檢測波長為326 nm，流速1.0 mL /min，柱溫30 ℃。

2.3 線性關系考察 按“2.2”色譜條件分別進樣1、3、5、7、10、15 μL進行測定，以黃芩苷的進樣質量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，得到黃芩苷的回歸方程為Y=1808.8865*Amt+14.1250,相關系數為0.99970。

2.4 精密度 精密吸取清咽利喉合劑(批號：20181214-1)供試品溶液10 μL，按“2.2”色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，結果峰面積的RSD%為0.12%，表明儀器的精密度良好。

2.5 專屬性 將陰性樣品溶液按 “2.2”項下色譜條件進行分析，結果見圖1，在與樣品主峰保留時間處未出現相應的色譜峰。

2.6 穩定性試驗 精密量取清咽利喉合劑(批號：20181214-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄黃芩苷色譜峰的面積，結果峰面積的RSD為0.35%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 精密量取清咽利喉合劑(批號：20181214-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.2”色譜條件測定，測定黃芩苷的峰面積，計算黃芩苷的平均含量為2.663 mg/mL，RSD為0.49%，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密量取清咽利喉合劑(批號：20190127-1)1.0 mL，置50 mL 量瓶中，共6份，分成三組，每組分別依次精密加入黃芩苷0.05785 mg/mL 的對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL，照“2.2”項下方法制備供試品溶液，濾過，取續濾液，經0.4 μm濾膜濾過即得。按“2.3”色譜條件，精密吸取6份供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄黃芩苷峰面積，按外標法計算黃芩苷的含量，并計算回收率。平均回收率為99.9%，RSD為0.62%，回收率良好，符合分析方法的要求。回收率結果見表1。

表1 回收率測定結果

2.9 樣品含量測定 精密量取3批清咽利喉合劑(批號：20181214-1、20181207-1、20190110-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，每批次平行操作2份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”色譜條件測定，外標法計算各供試品溶液中黃芩苷的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 參照《中國藥典》2015年版中黃芩含量測定，甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸為流動相，檢測波長為326 nm，流速1.0 mL /min，柱溫30 ℃，結果表明，以乙腈-0.1%磷酸為流動相的供試品色譜峰分離度較好，達到基線分離。

3.2 提取溶劑和提取方法 分別考察了超聲提取法和回流提取法兩種提取方法及不同提取溶劑(甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇)，結果表明，超聲提取效率較水浴加熱回流高，其中提取效率50%乙醇>甲醇>70%乙醇>乙醇。因此采用50%乙醇作為提取溶劑，超聲處理的方法，該操作方法簡單易行，且主峰和雜質峰分離較好。

3.3 提取時間的考察 精密量取清咽利喉合劑2.00 mL，3份，置50 mL 量瓶中，加入35 mL 50%乙醇，分別超聲處理20、30、40 min，結果表明，該樣品中黃芩苷的含量經超聲處理30 min可提取完全。

綜上所述，實驗采用高效液相色譜法測定清咽利喉合劑中黃芩苷的含量，操作簡單，精密度高，穩定性好，可以作為本制劑的監控指標，更好的控制該制劑的質量。