細胞遺傳學綜合性實驗的設計與實踐

李 楠， 郭海濱， 李亞娟， 勞媚媚

(華南農業大學 公共基礎課實驗教學中心，廣州 510642)

0 引 言

遺傳學是探究生物遺傳和變異規律的理論科學，是生命科學領域的基礎學科，研究內容豐富，小到基因結構、功能及表達，大到生物群落的遺傳特征[1]。遺傳學理論與實踐關系密切，實驗不僅是遺傳學的重要基礎，更是培養創新能力的重要環節[2]。劉向東等[3]結合國外“混合式學習”方法，提出了適合華南農業大學農科類專業的“創新型混合教學模式”遺傳學教學改革法。2009年，根據現代農業的需要，構建了四模塊、三層次、二整合和一方案的實驗內容和教學體系，探索出一套適合現代農學專業創新性實驗教學體系[4-5]。將依附理論課的實驗剝離，實現實驗教學的獨立設課，2014年農學院實踐教學大綱中，遺傳學實驗從8學時和16學時的驗證性實驗內容拓展到32學時、48學時和64學時綜合性、研究性實驗內容。突出了綜合性實驗對培養創新人才的重要性，推動了綜合性實驗的設計與應用。

綜合性實驗的設計思路主要來源于3方面：① 探索驗證性實驗間的共通性，提升為綜合性實驗，如經典遺傳學綜合性實驗。② 將科研項目成果(包括前沿的研究內容、新穎的材料與方法、科學的研究結果等)與實驗教學結合，提煉出綜合性實驗，如分子遺傳學綜合性實驗(包括DNA提取、PCR、電泳等)、基因工程實驗。③ 將大學生創新性實驗項目與實驗教學結合，利用其研究周期短、研究內容不深、研究方法創新等優勢，設計綜合性實驗項目。2012年至今，依托公共基礎課實驗教學中心立項的國家、省、校級創新訓練項目有83項，其中結合老師科研項目的有51項，結合實踐教學的有21項，該實驗的設計思路則來源于此。通過實驗教學證明，綜合性實驗在培養學生的綜合能力、創新能力及研究能力上發揮了重要的作用[6]。

1 秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂影響實驗設計

1.1 實驗目的

(1) 掌握生物顯微鏡操作技能，顯微圖像拍攝與統計分析系統使用技巧，有絲分裂制片技術。

(2) 學習人工誘導植物組織染色體變異方法和方差分析法。

(3) 掌握有絲分裂動態變化過程及染色體結構變異、數目變異等特征。

(4) 了解秋水仙素對植物遺傳與變異的影響，激發學生深入思考其他誘變劑(如重金屬、污水、洗滌劑等)對植物遺傳與變異的影響，開展下一步研究性實驗設計。

1.2 實驗原理

有絲分裂是真核生物細胞分裂的基本形式，各種生長旺盛的植物組織，如根尖、莖尖、愈傷組織等常進行著活躍的體細胞有絲分裂。有絲分裂可劃分為前期、中期、后期和末期。有絲分裂進程中，在一些因素的影響下(如物理因素、化學藥劑)，會干擾分裂進程，出現缺失、重復、倒位、易位及染色體數目增減等變異類型。并在以后的細胞分裂過程中產生一些異常的細胞學現象和特殊的遺傳學效應。如：缺失環、重復環、后期染色體橋、斷片、微核及加倍等[7]。

秋水仙素是一種常用誘變劑，是從百合科秋水仙屬的秋水仙(ColchicumautumnaleL.)器官和種子內提煉出來的一種植物堿。能阻止分裂細胞形成紡錘絲，使復制后的染色單體無法移向兩極，細胞不分裂，進而實現染色體加倍[8-9]。自1937年美國學者布萊克斯利等用秋水仙堿加倍成功曼陀羅的染色體后，秋水仙堿就被廣泛應用于細胞學、遺傳學的研究和植物育種中[10]。研究表明秋水仙素對實驗材料適當處理后，會影響細胞有絲分裂指數并誘發染色體結構變異，出現斷片、微核、雙核、后期橋、加倍等變異特征[11-12]。

1.3 實驗材料、試劑與儀器

實驗材料：洋蔥(2n=16)，購自農貿市場。

實驗試劑：秋水仙素,用蒸餾水配制成 0.1%秋水仙素溶液;卡諾固定液,無水酒精∶醋酸=3∶1;改良苯酚品紅,1 mL苯酚品紅+9 mL 45%冰醋酸+0.1 g山梨醇;鹽酸1 mol/L。

實驗儀器：恒溫生化培養箱(寧波萊福科技有限公司，PQX-330A-12HM)、顯微鏡(奧林帕斯，CX31)、水浴鍋。

1.4 實驗方法

1.4.1 洋蔥發根與誘導方法

洋蔥發根：取新鮮洋蔥鱗莖，剝去外層干枯鱗片，切去殘余老根，將鱗莖盤浸泡于蒸餾水中，于25 ℃培養箱中培養48 h，當不定根長出2 cm時備用。

誘導方法：以蒸餾水(CK)為對照，將不定根置于蒸餾水和0.1%濃度秋水仙素溶液中浸泡22 h后，于10 am取出，放入固定液中固定24 h，再經95%、80%乙醇中各停留30 min后，于70%的乙醇中保存備用。

1.4.2 有絲分裂制片技術

解離：取固定后的洋蔥根尖置于1 mol/L HCl溶液中60 ℃水浴13 min，再經蒸餾水反復浸泡3次，每次停留5 min。

制片：放1～2個根尖在載片上，用鑷子將根尖敲至漿狀。再用卡寶品紅染色液染色3～5 min，蓋片，用橡皮在蓋玻片上輕輕敲勻使細胞分散均勻，最后置于光學顯微鏡下觀察。

1.4.3 實驗要求與數據分析

在兩組對比實驗中，要求每人每組實驗處理至少3個洋蔥，根尖數在60條左右。

(1) 統計對照組與處理組的洋蔥根尖膨大率。

(2) 觀察有絲分裂動態變化過程及染色體結構變異、數目變異等細胞特征，并作圖。

(3) 每組實驗材料至少制作10張觀察片，利用顯微圖像拍攝與統計分析系統，記錄每張觀察片1 000細胞中處于有絲分裂各時期、后期橋、微核及加倍的細胞數目，利用方差分析法對比兩組實驗的有絲分裂指數和細胞染色體變異率，得出結論。

(4) 討論秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂影響。

變異細胞鑒別標準。微核鑒別①存在時相：微核在完整的分裂期細胞中，形態為圓形或橢圓；②體積：直徑小于主核的20%；③與主核的關系：與主核完全脫離；④染色：染色與主核完全一致。橋鑒別①存在時相：橋必須在完整的后期細胞中，形態為細胞兩端著絲粒共同牽引著一條染色體；②染色：染色與其他染色體完全一致。

數據分析：有絲分裂指數=分裂細胞數/觀察細胞總數；變異率=該類畸變細胞數/觀察細胞總數。

1.5 實驗結果與討論

(1) 洋蔥根尖膨大率統計。觀察兩組實驗中洋蔥根尖的外觀形態變化，記錄根尖膨大率，初步了解秋水仙素對植物外觀形態的影響。實驗結果表明，經秋水仙素溶液處理后洋蔥根尖膨大率較高，可達85%～95%。

主要儀器：Qubit? 2.0熒光計(Invitrogen Q32866)，凝膠成像系統(美國UVP)，PCR 儀(Eppendorf，T100TM Thermal Cyeler)，電泳儀電源（北京市六一儀器廠，DYY-6C型），臺式離心機（Thermo Fisher，Pico-21）。

(2) 觀察有絲分裂染色體動態變化過程及染色體結構變異、數目變異等細胞特征，并作圖如圖1、2所示。

1.間期

2.前期

3.中期

4.后期

5.末期

1.間期微核

2.后期染色體橋

3.中期加倍

(3) 利用方差分析法比較兩組實驗的有絲分裂指數和細胞染色體變異率，得出如圖3所示結論。

圖3 秋水仙素溶液對洋蔥根尖細胞分裂指數和變異率的影響

由圖3可知，秋水仙素有促進細胞有絲分裂的能力。以蒸餾水(CK)為對照，實驗表明洋蔥根尖細胞經秋水仙素溶液處理后處于前期、中期及分裂期的細胞指數明顯增加，均達到顯著或極顯著差異。尤其處于中期的細胞，與對照相比，達極顯著差異，表明秋水仙素具有促進細胞染色體停滯在中期的能力，這一實驗結果與前人研究一致[8-9]。

秋水仙素對洋蔥根尖細胞染色體有畸變效應。經秋水仙素溶液處理后，有絲分裂細胞中后期橋的變異率為0.31%，微核的變異率為0.43%，加倍的變異率為0.86%，與對照均達到極顯著差異。表明秋水仙素有誘導染色體產生后期橋、微核、加倍等變異現象。

通過實驗觀察與數據分析，因秋水仙素有促進細胞有絲分裂能力和誘導染色體產生畸變效應，進而致使洋蔥根尖從外觀形態上表現出膨大特征。說明部分化學試劑對植物遺傳有影響，進而影響植物外觀形態、生長發育，甚至威脅生命健康。

2 綜合性實驗的實踐體會

2.1 驗證性實驗與綜合性實驗優勢互補

驗證性實驗在實踐教學中已運用多年，在印證理論知識上有著不可替代性作用，是學生實驗的入門基礎，可規范和培養學生的基本實驗技能[13]。綜合性實驗則是在驗證性實驗基礎上的提升，旨在提高學生綜合應用知識的能力、創新能力及研究能力。該細胞遺傳學綜合性實驗利用了對比的方法，融合了驗證性實驗和綜合性實驗內容，實現了兩者的優勢互補。

2.2 傳授式教學與問題引導式教學相結合

在結構變異驗證性實驗教學中，因實驗材料、誘導劑、誘導方式、變異率、學生操作、課堂時間等綜合因素的影響，致課堂中只有部分學生可觀察到結構變異現象，且觀察的變異類型少。針對該問題，老師與學生進行深入探討，激發學生思考。部分學生會利用大學生創新訓練項目、畢業論文等形式，在老師指導下開展研究，如綠茶對植物染色體變異的抑制作用研究、秋水仙素誘導洋蔥根尖染色體結構變異研究、植物根尖微核及染色體畸變技術研究等。

老師將學生的研究成果與實驗教學結合，總結提煉出該細胞遺傳學綜合性實驗。教學過程中采用了傳授式教學法與問題引導式教學法相結合[14]，提出秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂有怎樣影響的問題，并結合理論教學講授有絲分裂驗證性實驗原理及方法，提供相關參考文獻資料。學生結合問題和學習資料，設計實驗，開展綜合性實驗研究。并在綜合性實驗基礎上，老師進一步引導式提問，如是否有感興趣的實驗材料？是否想了解秋水仙素或是其他誘變劑對該材料的影響？是否想了解環境污染與植物遺傳的關系？等，引導學生發散思維，進行創新型實驗設計。

2.3 開展創新研究性實驗，自我提升綜合能力

在整個實驗過程中學生的主觀能動性非常重要，一方面需要學習合理利用經費和時間，購置實驗用品，安排研究進程，保證實驗的順利完成；另一方面需要發揮團隊合力，拓展遺傳學及相關學科的理論和實踐知識，并將其運用于實驗研究中解決困難，最終實現自我創新能力、科研能力、綜合能力的提升。

2.4 改進實驗材料，提升觀察效果

以前結構變異誘導與鑒定實驗一直以伽瑪射線(吸收劑量為31.0～40.0 Gy)輻照大蔥小孢子母細胞產生結構變異作為實驗材料，但該材料的教學應用效果并不理想。微核的誘導率為0.21%，后期橋的誘導率為0.11%。從每年上課反饋的數據分析，使用大蔥幼花材料，每班僅20%左右的同學觀察到“微核”現象，觀察到“后期橋”現象的少于10%。

自從以秋水仙素誘導洋蔥根尖細胞產生結構變異作為實驗材料后，微核的誘導率達0.43%，后期橋的誘導率達0.31%。平均每班通過實驗操作觀察到細胞分裂相的學生達90%以上，觀察到微核的達84%，觀察到“后期橋”現象的達55%，觀察到染色體加倍等異常現象的達59%(見表1、2)。相較大蔥幼花實驗材料，有更多學生觀察到染色體結構變異現象，在教學應用中取得了很好的觀察效果。

表1 遺傳學實驗室2016年本科遺傳學實驗教學情況匯總表

表2 學生觀察到各種染色體結構變異現象的人數統計

另外，秋水仙素誘導洋蔥根尖細胞產生的變異類型多，如不均等分裂、多核、斷片、染色體數目上的各種變異等[15]。這些現象會引起學生探究的興趣，觸發學生與老師交流，實現老師與學生共同學習和研究的目的。

3 結 語

該細胞遺傳學系列實驗采用了“驗證性-綜合設計性-創新研究性實驗”的多層次、研究性實驗教學方式，對提高學生的綜合能力、創新能力及研究能力有顯著效果。驗證性實驗、綜合性實驗、研究性實驗屬于科學實驗的方法，是層層遞進的關系，在培養學生綜合創新能力上發揮著不可替代性作用。驗證性實驗是學生進入科學研究領域前的基石，旨在讓學生掌握實驗的基本技能，老師對學生的教學方式，主要以面對面的傳授式教學法。在適當時機以問題引導的教學方式，激發學生思考，順利進入綜合性實驗研究。綜合性實驗是學生進入科研研究領域前的傳送帶，旨在激發學生研究的興趣，學習研究的基本方法。老師對學生的教學方式，需根據綜合性實驗的特點，采用組合式教學法，如傳授式、問題引導式、翻轉課堂式、專題式、自主研究式、分組合作式、討論分析式等[16-17]。研究性實驗是學生進入科學研究領域的縮影，旨在讓學生了解科學研究的過程、問題及方法，進而培養學生獨立研究、團隊合作、創新思維及解決問題的能力[18]。老師對學生的教學方式，是以學生為主體，老師作為學習團隊中的一員，扮演建議者、引導者、鼓勵者的角色。實驗教學改革中，一直摸索著如何在有限的教學時空里，融合這三者的優勢，配以行之有效的教學方法，實現創新型、研究型人才的培養。