阿魏酸對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用

鐘正靈，江玉華，楊沿浪，張 飛，張煒婷，童九翠，李 娟，儲冀汝，謝海棠*

(1.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 《中國臨床藥理學與治療學》編輯部，安徽 蕪湖 241000；2.皖南醫學院 藥學，安徽 蕪湖 241000；3.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 腎內科，安徽 蕪湖 241000；4.皖南醫學院 臨床醫學，安徽 蕪湖 241000；5.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 臨床藥物評價中心，安徽 蕪湖 241000)

急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)是各種間接和直接致傷因素(包括機械因素、化學因素、生物因素)導致的毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞損傷，致使急性低氧性呼吸功能不全。以通氣/血流比例失調、肺順應性降低、肺容積減少為病理生理特征，臨床上表現為呼吸窘迫和進行性低氧血癥，其嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征。多中心流行病學研究結果提示中國ALI的病死率遠高于西方發達國家[1-2]。ALI具有較高的死亡率和發病率，并且近年呈現增高趨勢，目前仍缺乏有效的治療方法，對該病的治療及其發病機制的研究一直以來都是危重癥醫學領域關注的熱點問題[3-5]。

目前臨床上主要使用糖皮質激素、利索茶堿、表面活性劑、N-乙酰半胱氨酸和魚油等藥物治療ALI，這些藥物對ALI有一定的作用，但同時存在各種毒副作用，治療效果均不理想[6-8]。雖然國內外針對ALI治療的基礎研究和臨床實驗也較多，但目前尚無特效的治療藥物。

當歸可預防和治療放射性肺損傷[9]。當歸須散能顯著降低急性肺挫傷患者炎性細胞因子水平，抑制炎性反應，阻斷肺損傷的演變進程，縮短康復時間[10]。阿魏酸(Ferulic Acid，FA)是從當歸中提取的有效活性成分之一。文獻研究表明阿魏酸在當歸中的含量為0.06%[11]，經高效液相色譜檢測顯示，當歸含藥血清主要成分含有阿魏酸[12-13]。當歸對肺損傷的保護作用是否是阿魏酸發揮藥效作用尚未可知。因此，實驗以BALB/c小鼠為研究對象，探討阿魏酸對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠是否具有保護效應。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑

阿魏酸(含量為98%，使用時用生理鹽水進行配制)，購于南京建成生物工程研究所(批號：F103701)；脂多糖，購于美國Sigma公司(批號：1020031)；地塞米松磷酸鈉注射液，購于辰欣藥業股份有限公司(批號：1708232121)；無水乙醇、戊巴比妥試劑均為市售分析純。TNF-α試劑盒(批號：RK00027)、IL-6試劑盒(批號：RK00008)、IL-1β試劑盒(批號：RK00006)，均購于ABclonal Biotechnology Co.，Ltd。

1.2 儀器與設備

UPT-Ⅱ-20T型超純水器(成都超純科技有限公司)；電子分析天平(FA1004)；高速冷凍離心機(Thermo XIR)；FC型酶標儀(美國Thermo公司)；50 uL微量進樣器(上海高河工貿有限公司)；ELISA專用微量振蕩器(MX-100-4A，杭州奧盛儀器有限公司)；LRHS恒溫干燥箱(DHG-9023A，東莞環瑞環境測試設備廠)；RM2245型轉輪式切片機(德國徠卡公司)；BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 動物

BALB/c小鼠，(20±2) g，雄性，SPF級，購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場，許可證號:SCXK(蘇)2017-0001，動物合格證號:201704335。

1.4 分組與給藥

60只小鼠適應性飼養2周后隨機分為6組：正常對照組，模型組，阿魏酸高(30 mg/kg)、中(15 mg/kg)、低劑量組(7.5 mg/kg)和地塞米松組(2 mg/kg)，每組10只。灌胃給藥，正常對照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，每天1次。連續給藥7 d，末次給藥后2 h，正常對照組給予同體積生理鹽水，其余各組均通過微量進樣器氣管快速滴注脂多糖(10 mg/kg)[14]，禁食不禁水，造模6 h后，小鼠眼部采血，處死小鼠，迅速取出小鼠的肺組織。

1.5 肺組織濕/干重比值測定

取出小鼠的右肺上葉，除去結締組織，用生理鹽水清洗數次并用濾紙吸干后稱濕重，放在80 ℃恒溫干燥箱中連續干燥72 h以上，分別稱量肺組織干重并記錄，計算小鼠肺組織濕/干重比值[15]。

1.6 ELISA法測定血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量

按照ELISA試劑盒說明書分別測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.7 肺組織病理學觀察

取小鼠左肺上葉肺組織適量，將肺組織固定于多聚甲醛溶液中，24 h后取出，用生理鹽水充分沖洗后甲酸脫鈣，并進行常規脫水、浸蠟、包埋，制備蠟塊，使用切片機切成超薄切片，去石蠟，并用蘇木素-伊紅染液染色，采用BI-2000醫學圖像分析系統進行拍照以及圖像分析觀察肺組織形態改變(×200)。

圖1 阿魏酸對急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響(x±s，n=10)

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 阿魏酸對急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肺組織濕/干重比值明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組與阿魏酸高、中、低劑量組小鼠肺組織濕/干重比值明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，阿魏酸對急性肺損傷小鼠肺組織濕/干重比值的影響如圖1所示。由圖1可知，阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠肺組織水腫。

2.2 阿魏酸對急性肺損傷小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，地塞米松組與阿魏酸高、中、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。各組小鼠肺組織濕/重比值及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量如表1所示，結果表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠血清炎癥因子水平。

表1 各組小鼠肺組織濕/重比值及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

與正常對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，eP<0.05。

2.3 各組小鼠肺組織病理形態學變化

正常對照組肺組織結構完整，肺泡間隔之間無水腫，肺組織未見明顯病理改變；模型組肺組織可見肺泡間隔增厚，大量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔縮小，含有較多的炎性細胞；地塞米松組上述變化明顯減輕；阿魏酸低、中、高劑量組上述變化依次減輕，僅見肺泡間隔少量炎性細胞。各組小鼠的肺組織病理形態學變化如圖2所示。

圖2 各組小鼠的肺組織病理形態學變化圖(×200)

3 討論

ALI是由多種原因導致的急性呼吸功能障礙，彌漫性肺間質及肺泡水腫，肺內失控的炎癥細胞因子和炎癥細胞的大量釋放為其主要病理表現[16-17]。耿焱[18]等對勞力型與經典型熱射病大鼠急性肺損傷的病理特點及時程變化進行比較，結果發現急性肺損傷大鼠損傷早期病理改變主要為少量的炎性細胞浸潤和間質毛細血管擴張充血，中暑6 h后肺臟損傷加重，肺泡結構模糊，間質血管顯著擴張充血，出現肺泡腔出血；中暑24 h后大鼠肺損傷進一步加重，肺泡間隔和肺泡中充滿了大量紅細胞，大量的炎性細胞浸潤肺間質，間質明顯增厚。實驗結果顯示，與模型組比較，阿魏酸高、中、低劑量組肺濕/干重比值明顯降低，表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠肺組織水腫。病理圖片顯示模型組肺泡間隔增厚，大量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔縮小，含有較多炎性細胞；阿魏酸高、中、低劑量組上述變化明顯減輕，僅見肺泡間隔內少量炎性細胞。

脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，可直接作用于肺組織，破壞肺泡引起出血、肺水腫，使壞死組織、炎性細胞堆積，促使肺泡巨噬細胞和炎性反應鏈的激活，導致肺內炎性反應[19]。TNF-α是導致急性肺損傷的關鍵細胞因子，主要來源于脂多糖刺激T細胞、單核細胞、巨噬細胞等。TNF-α能導致多種促炎細胞因子和炎癥介質的過度釋放，并進一步激發炎癥級聯反應[20]。IL-6是由激活的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，涉及肺內炎癥的過度反應，是肺內主要的炎癥因子之一[21]。TNF-α和IL-6均具有觸發炎癥反應的作用[22]。IL-1β是由激活的單核巨噬細胞、中性粒細胞、表皮細胞和內皮細胞所分泌，IL-1β是炎癥放大啟動因子，參與炎癥的發生和發展[18]。實驗結果顯示，與模型組比較，阿魏酸高、中、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明顯降低，表明阿魏酸可以顯著降低急性肺損傷小鼠血清炎癥因子水平。