HSCCC分離荷葉原花青素及其抗氧化活性研究

高 亮，蔡為榮，張孟雪，岳丹偉

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

荷葉為睡蓮科植物蓮(Nymphaeaceae Genus)的干燥葉，味苦性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有升發(fā)清陽(yáng)、涼血止血等功效 ,現(xiàn)代研究表明荷葉具有調(diào)節(jié)血脂、止咳化痰、降低血壓等作用[1]。《本草綱目》記載：“荷葉服之，令人瘦劣。單服可以消陽(yáng)水浮之氣”。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部在1991年第45號(hào)文件將荷葉列入第二批“既是食品又是藥品”名單[2]。研究表明：荷葉富含原花青素、黃酮、槲皮素、生物堿等，具有抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。原花青素(Poranthocyanidins，OPC)是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃烷醇及其聚合體，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成[3-4]。對(duì)原花青素最早的研究始于20世紀(jì)50年代，法國(guó)科學(xué)家Masquelier J首次從松樹(shù)皮中提取出該類物質(zhì)[5]。原花青素是由兒茶素和表兒茶素通過(guò)不同聚合度聚合而成的一類聚合物，上下單元間以4～8或4～6位C-C鍵相連，從而形成具有不同聚合度的聚合物。原花青素廣泛存在于自然界的植物中，在某些植物的皮和籽中含量較高。高速逆流色譜(HSCCC)分離技術(shù)是一種新興的色譜分離技術(shù)，相對(duì)于一般分離技術(shù)而言，其特點(diǎn)在于流動(dòng)相和固定相都為液體，沒(méi)有不可逆吸附，具有分離效率高，對(duì)樣品無(wú)損耗，制備量大等優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)于高速逆流色譜分離原花青素的研究較少，N Savitri Kumar[6]等利用高速逆流色譜分離茶葉中的原花青素。近些年來(lái)的研究證明，原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，此外還可以降血壓、提高血管活性，對(duì)缺血-再灌注損傷、抗動(dòng)脈粥狀硬化以及抗血小板凝固有很高的醫(yī)療價(jià)值；在抗腫瘤方面，對(duì)多種癌細(xì)胞，例如乳腺、前列腺癌細(xì)胞等都有一定程度的抑制作用。關(guān)于荷葉原花青素，采用高速逆流色譜分離技術(shù)相對(duì)于之前的相關(guān)研究具有一定的創(chuàng)新，為分離荷葉原花青素提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

荷葉采摘自校內(nèi)池塘，洗凈，放入40 ℃烘箱(常壓下)內(nèi)烘干，過(guò)80目篩，封口后保存于干燥陰涼處；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號(hào)7295-85-4)，表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號(hào)490-46-0)，表兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號(hào)490-46-0)(含量均>98%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品(含量>98%，CAS編號(hào)29106-49-8，南京市淵科技有限公司)；乙醇、乙酸乙酯、乙酸、石油醚(均為分析純)，乙腈、甲醇(均為色譜純)(國(guó)藥集團(tuán)有限公司)；正己烷(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；AB-8大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)化工廠)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

表1 主要儀器與設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)荷葉原花青素樣品的制備。取干燥后的干荷葉粉以料液比1∶20加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在40 ℃條件下水浴加熱1 h，抽濾后浸提兩次，洗滌濾渣。將兩次提取液合并，減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，再用AB-8大孔樹(shù)脂洗脫除去糖類、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。方法為將濃縮液上樣放入經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的樹(shù)脂柱中進(jìn)行純化，先用蒸餾水洗去雜質(zhì)至流出液無(wú)色，用45%乙醇溶液洗脫并收集洗脫液，再將洗脫液減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，之后加入飽和的NaCl溶液。經(jīng)過(guò)濾后，先用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，再用2倍體積的石油醚沉淀兩次，最終得到荷葉原花青素樣品。將其放入冷凍干燥機(jī)中，凍干成粉備用。顯色劑：10%香草醛鹽酸溶液。

(2)HSCCC法分離荷葉原花青素溶劑體系的選擇。分離溶劑體系的選擇對(duì)于高速逆流分離效果的好壞有著重大的影響。一個(gè)好的溶劑體系應(yīng)該具備以下3個(gè)條件：具備較高的固定相保留率；分配系數(shù)K范圍應(yīng)該在0.5

(3)HSCCC分離純化原花青素。配好所選的溶劑體系倒入分液漏斗中，充分搖勻，并記錄分層時(shí)間，分配半小時(shí)達(dá)到平衡，倒出上下相溶劑，超聲脫氣30 min備用。取上述濃縮后的浸膏0.5 g，取等量上、下相將其溶解，過(guò)0.45 μm過(guò)濾器后作為樣液。先打開(kāi)紫外檢測(cè)器開(kāi)始預(yù)熱，以流速40 mL/min泵入固定相，待固定相充滿整個(gè)管路后，色譜檢測(cè)器出口端流出固定體積相約為50 mL后停泵。將主機(jī)調(diào)至正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為900 r/min，同時(shí)以2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相，至檢測(cè)器出口端流出液體且紫外信號(hào)穩(wěn)定，此時(shí)系統(tǒng)達(dá)到平衡，進(jìn)樣10 mL并啟動(dòng)色譜工作站記錄譜圖，同時(shí)將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為280 nm，分峰段收集出口段的組分用于之后的HPLC檢測(cè)。

(4)高效液相色譜鑒定。色譜條件：流動(dòng)相B：乙腈，流動(dòng)相A：0.4%乙酸水溶液；色譜柱：C18，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，將上述組分配制成甲醇溶液，用于HPLC檢測(cè)，洗脫程序。HPLC洗脫條件如表2所示。

表2 HPLC洗脫條件

(5)原花青素含量的測(cè)定。研究采用香草醛鹽酸法測(cè)定原花青素的含量，按條件配制A液B液，其中A液為1%的香草醛甲醇溶液，B液為8%的鹽酸甲醇溶液。將A液B液按照1∶1的比例混合成顯色劑。配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2 mg/mL，分別取標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL定容至10 mL，分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入5 mL顯色劑，在避光條件下30 ℃水浴加熱30 min，隨后測(cè)定吸光度并繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣液1 mL加入顯色劑測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其原花青素的質(zhì)量濃度，并計(jì)算出原花青素含量。計(jì)算公式如下：

M=C×V,

式中，C為原花青素質(zhì)量濃度；V為樣品體積；M為原花青素質(zhì)量。

(6)荷葉原花青素組分的抗氧化活性研究。對(duì)高速逆流色譜分離出的組分進(jìn)行抗氧化活性研究即對(duì)所得組分進(jìn)行清除DPPH、ABTS+和羥基自由基的能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

①DPPH自由基清除率的測(cè)定：參考孫志武[11]等的方法略作改動(dòng)，分別吸取0.4 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于試管中，加入2 mL 0.1 mmoL/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度記為A2；吸取0.4 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度記為A1；吸取0.4 mL無(wú)水乙醇，加入2 mL 0.1 mmoL/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度記為A0。同時(shí)測(cè)定維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率作為對(duì)比。按照下列公式計(jì)算清除率：

②ABTS+自由基清除率的測(cè)定：參照蔣孟君[12]等的方法，將0.5 mL不同質(zhì)量濃度原花青素溶液與4 mL ABTS+工作液混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)其吸光度A2；將0.5 mL超純水與4 mL ABTS+工作液混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)其吸光度A0；將0.5 mL不同質(zhì)量濃度原花青素溶液與4 mL無(wú)水乙醇混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)其吸光度A1。以VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，按照下列公式計(jì)算清除率：

③羥基自由基清除率測(cè)定：參考楊芬[13]等的方法略作改動(dòng)，采用水楊酸法測(cè)定原花青素對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用。吸取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL,分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和1.5 mL水楊酸乙醇溶液，然后加入0.1 mL 0.03% H2O2，置于37 ℃中水浴加熱0.5 h后3 000 r/min離心分離10 min，于510 nm處測(cè)吸光度記為A1,VC作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得吸光度記為A0，再取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL，分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和1.5 mL水楊酸乙醇溶液，然后加入0.1 mL H2O，于510 nm處測(cè)得吸光度記為A2羥基自由基(·OH)。清除率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC分離荷葉原花青素

高速逆流色譜技術(shù)分離經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的荷葉原花青素HSCCC色譜圖如圖1所示。其中溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80。

圖1 高速逆流色譜技術(shù)分離經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的荷葉原花青素HSCCC色譜圖

2.2 荷葉原花青素色譜分析

根據(jù)HPLC圖可知，共檢測(cè)出四種原花青素物質(zhì)，其中包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸和原花青素B2。四種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品圖如圖2所示。由圖2可知，從左至右依次為兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、原花青素B2。原花青素樣品的HPLC圖如圖3所示。經(jīng)HSCCC分離后的組分G1的HPLC圖如圖4所示。由圖4可知，組分G1中含有表兒茶素沒(méi)食子酸酯和原花青素B2。經(jīng)HSCCC分離后的組分G2的HPLC圖如圖5所示。由圖5可知，G2為表兒茶素。經(jīng)過(guò)HSCCC分離后的組分G3的HPLC圖如圖6所示。由圖6可知，G3為兒茶素。

圖2 四種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品圖

圖3 原花青素樣品的HPLC圖

圖4 經(jīng)HSCCC分離后的組分G1的HPLC圖

圖5 經(jīng)HSCCC分離后的組分G2的HPLC圖

圖6 經(jīng)過(guò)HSCCC分離后的組分G3的HPLC圖

2.3 HSCCC分離純化原花青素條件的建立

溶劑系統(tǒng)的選擇對(duì)分離效果至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的溶劑體系對(duì)于荷葉原花青素分離效果的影響。以上下相溶劑系統(tǒng)的分層時(shí)間以及物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，得到溶劑體系正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80，按比例將溶劑配置好，再將配置好的溶劑放入分液漏斗中，搖勻上下相，記錄分層時(shí)間。以上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，以40 mL/min泵入上相，再以2 mL/min泵入下相，水浴溫度設(shè)為25 ℃，轉(zhuǎn)速為900 r/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為280 nm，收集峰組分，電腦記錄譜圖。固定相保留率為62%。其中保留率計(jì)算公式為：

式中，V總為柱總體積；V流為固定相被流動(dòng)相排出的體積。

分配系數(shù)K的測(cè)定。使用分液漏斗配置好溶劑系統(tǒng)，充分搖勻，靜置平衡，記錄溶劑系統(tǒng)分層時(shí)間T。取適量荷葉原花青素凍干樣用下相溶解，取3 mL下相加入相同體積上相充分混合，分離上下相用于高效液相色譜檢測(cè)，分配系數(shù)K計(jì)算公式為：

式中，A1為荷葉原花青素目標(biāo)組分在上相中的峰面積；A2為荷葉原花青素目標(biāo)組分在下相中的峰面積。

HSCCC溶劑體系表如表3所示。從表3中可以看出,溶劑體系2和溶劑體系3溶劑系統(tǒng)分層時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而溶劑體系4則分配系數(shù)過(guò)大且溶劑系統(tǒng)分層時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，據(jù)此選擇溶劑體系1作為高速逆流色譜分離的溶劑體系。

表3 HSCCC溶劑體系表

2.4 荷葉原花青素抗氧化活性研究

(1)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)DPPH自由基的清除率如圖7所示。HSCCC分離出的三種組分對(duì)DPPH自由基的清除率，隨著三種物質(zhì)質(zhì)量濃度增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之增加。在樣品質(zhì)量濃度為0.03 mg/L時(shí)，DPPH自由基的清除率為G2>G1>G3>VC，當(dāng)VC質(zhì)量濃度在0.15～0.27 mg/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增加，VC對(duì)DPPH的清除率顯著提升。當(dāng)三種組分樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.27 mg/L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率變化趨于穩(wěn)定。當(dāng)VC質(zhì)量濃度達(dá)到0.39 mg/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為88.21%。由圖7可知三種組分與VC的自由基半數(shù)清除數(shù)有顯著差異， 且G2的DPPH自由基清除率最高。

圖7 荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)DPPH自由基的清除率

(2)ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)。荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)ABTS+自由基的清除率的變化如圖8所示。由圖8可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基的清除率也逐步增加。從半數(shù)自由基清除數(shù)上看，G3的自由基清除效果最好。自由基清除率大小為G3>G2>G1>VC，在質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg/mL時(shí)，G1與VC的自由基清除率差別較小。在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL時(shí)，G3的自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加有顯著提升。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，自由基清除率趨于穩(wěn)定。G3的IC50值顯著小于其他組分，具有良好的ABTS+自由基清除能力。

(3)羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)。荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)羥基自由基的清除率大小的變化如圖9所示。由圖9可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，羥基自由基的清除率也在逐步增加，從半數(shù)清除自由基上看，G3的自由基清除效果最好，清除率大小為G3>G2>G1>VC，總體而言，分離出的原花青素各個(gè)組分的羥基自由基清除率都要優(yōu)于VC。

圖8 荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)ABTS+自由基的清除率的變化 圖9 荷葉原花青素經(jīng)過(guò)高速逆流色譜分離出的三種組分對(duì)羥基自由基的清除率大小的變化

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用了高速逆流色譜分離技術(shù)，對(duì)荷葉原花青素進(jìn)行分離，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定采用溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80，收集分離出的三種組分經(jīng)HPLC鑒定表明G1為表兒茶素沒(méi)食子酸酯和原花青素B2，G2為表兒茶素，G3為兒茶素。將HSCCC分離出的三種組分進(jìn)行抗氧化活性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DPPH自由基清除效能G2>G1>G3>VC，ABTS+自由基清除效能G3>G2>G1>VC，羥基自由基清除率大小為G3>G2>G1>VC。研究通過(guò)高速色譜法有效地將荷葉原花青素中的目標(biāo)組分分離出來(lái)，并進(jìn)行相應(yīng)抗氧化活性研究，為荷葉資源應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了一定的參考。較其他研究而言，實(shí)驗(yàn)采用的高速逆流色譜有著快捷高效等特點(diǎn)，后期還需對(duì)組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及分離純化工藝優(yōu)化，以便為荷葉資源的開(kāi)發(fā)利用提供更多的參考。