miR-101和RanBP9在隱睪睪丸組織中的表達及其意義

程 鵬，黃振宇，竇賢明，毛 軍，徐雨辰，張賢生

隱睪是指在生長發育過程中，一側或者雙側睪丸未能下降到陰囊內，又稱為睪丸下降不全，是男性生殖系統中一種常見的先天性疾病。隱睪癥在足月新生兒中的發病率約為2%～4%，但在早產兒中可達到30%；但是，大約有80%的隱睪患兒在出生后的第一年內睪丸會下降到陰囊內，從而使得隱睪癥的發病率約為1%[1]。隱睪可以破壞正常的精子發生，導致男性不育，是成年男性非梗阻性無精癥的一種常見病因，但是其發病機制尚不明確。

近年來，越來越多的文獻報道microRNAs(miRNAs)參與精子發生。miR-101是一種脊椎動物中進化上保守的miRNA，已被鑒定為前列腺癌中的腫瘤抑制因子[2]。RanBP9是一種腳手架蛋白，研究[3-4]顯示RanBP9敲除的小鼠精子發生過程嚴重受損。前期研究[5]表明miR-101在小鼠海馬神經元中靶向結合RanBP9并調控其表達，但是miR-101和RanBP9在隱睪中的作用尚未見報道。該研究通過構建隱睪小鼠模型，研究miR-101和RanBP9在隱睪中的表達變化情況及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞及主要試劑ICR雄性小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心，SPF級，6周齡，共60只。飼養于室溫24 ℃、濕度50%、通風良好環境中。小鼠精母細胞系GC-2細胞由中國科學技術大學生命科學院饋贈；該實驗所用的小鼠miR-101模擬物(miR-101 mimic)、miR-101抑制劑(miR-101 inhibitor)及對照組購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗RanBP9抗體、山羊抗兔GAPDH抗體購自abcam公司；蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；免疫熒光二抗：山羊抗兔熒光二抗抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠隱睪造模 將60只ICR小鼠隨機分為單側隱睪組和假手術組，每組各30只。30只隱睪組小鼠麻醉后，將左側睪丸牽拉至腹腔內，切斷引帶，縫合脂肪墊于腹膜上，造左側隱睪組(Cry組)；右側睪丸仍位于陰囊內，作為自身對照組(SC組)。另外30只假手術組小鼠麻醉后做相同腹側切口，牽拉左側睪丸，但睪丸仍處于陰囊內，左側睪丸作為對照組(Con組)。分別于術后3、7、14、21、28 d行頸椎離斷處死。

1.2.2細胞培養與轉染 GC-2細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養；當細胞長滿時，用胰酶消化，將細胞接種于6孔板中培養24 h，進行RNA轉染實驗，具體操作步驟嚴格按照Lipofectamine 2000轉染說明書進行。轉染48 h后收集miR-101 mimic組(記為miR-101)、miR-101 inhibitor組(記為ImiR-101)及其各自對照組(NC：miR-101 mimic組的對照組；INC：miR-101 inhibitor組的對照組)細胞提取RNA，進行熒光定量PCR檢測miR-101的表達量；收集各組細胞提取蛋白后進行Western blot實驗，檢測RanBP9的表達量。

1.2.3Western blot實驗 將各時間段收集的小鼠睪丸組織和轉染后的細胞用RIPA裂解液處理30 min，之后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法進行蛋白定量，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白分離后，轉移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加抗RanBP9抗體(1 ∶1 000)，抗GAPDH抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL顯影液顯影。

1.2.4熒光定量PCR實驗 收集轉染后的細胞和各時間段的小鼠睪丸組織，按TRIzol試劑說明書提取各組總RNA，逆轉錄成cDNA，再進行熒光定量PCR檢測。引物序列如下：miR-101 F:5′-CACGCATACAGTACTGTG-3′,R:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；RanBP9 F: 5′-AATGTGGCAAGAACACAGCA-3′,R:5′-TGGGTCAAGCTGATTTCCAA-3′；18S RNA F:5′-CGCTACTACCGATTGGATGG-3′,R: 5′-AGTTCGACCGTCTTCTCAGC-3′。以18S mRNA表達水平作為內參，采用2-ΔΔCt比較分析各組間miR-101和RanBP9的表達差異。

1.2.5HE染色 睪丸組織經過10%福爾馬林固定24 h后，經梯度酒精脫水和二甲苯透明后制作蠟塊。4 μm連續切片，切片經二甲苯、酒精脫蠟水化，蘇木精染色，流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色。脫水封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.6免疫熒光染色 4 μm的石蠟切片，60 ℃烘片2 h，經二甲苯、酒精脫蠟水化；切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中抗原修復，微波爐加熱20 min，自然冷卻到室溫；PBS洗3次，每次5 min；5%BSA封閉30 min；加一抗(1 ∶100)4 ℃過夜；復溫30 min后PBS洗3次，每次5 min；加相應二抗(1 ∶100)室溫孵育1 h(避光)；PBS洗3次，每次5 min；DAPI避光孵育5～10 min，PBS洗3次，每次1 min；封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 小鼠睪丸形態學變化術后3、7、14、21、28 d小鼠體質量的改變無統計學意義，表明手術對小鼠的生長無明顯影響(表1)。術后3 d Cry組小鼠睪丸較SC組和Con組睪丸稍增大，可能是因為術后水腫。在術后14 d時Cry組睪丸體積明顯減小(圖1A)。通過對小鼠睪丸體質量比(睪丸重量/體質量×100%)進行分析，如圖1B顯示，在術后第7天，Cry組較SC組和Con組明顯減小，差異有統計學意義(F=8.764，P<0.01)。通過對睪丸組織進行HE染色，術后3 d Cry組與SC組及Con組進行比較后發現睪丸形態結構基本正常，生精細胞數目及形態無明顯改變，術后7 d開始Cry組睪丸組織生精細胞數目開始減少，同時睪丸結構也出現了損壞，至術后28 d時睪丸結構完全破壞，顯微鏡下睪丸組織出現空泡，各級生精細胞缺失且不易辨認，無法形成完整的精子細胞；相反，SC組和Con組睪丸組織可見各級生精細胞，睪丸組織形態完好(圖1C)。

表1 各個時間段Cry組和Con組小鼠體質量比較

2.2 miR-101影響RanBP9在睪丸中的表達向GC-2細胞轉染miR-101 mimic和inhibitor 48 h后，qRT-PCR結果顯示miR-101表達量在mimic組顯著增加，而在miR-101 inhibitor組表達量顯著較少, 差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A、2B。通過Western blot實驗檢測RanBP9的表達量，結果顯示轉染miR-101 mimic后RanBP9的表達是減少的，相反，轉染miR-101 inhibitor后RanBP9的表達是增加的(圖2C、2D)。以上結果表明在生精細胞系中miR-101可以下調RanBP9的表達。

2.3 miR-101和RanBP9在隱睪中的表達情況qRT-PCR結果顯示與SC組和Con組相比，隱睪組中miR-101的表達量在術后7 d開始升高，而RanBP9的表達量在術后14 d出現明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A、B。隱睪組睪丸中miR-101表達量隨著隱睪手術后時間的推移發生改變，從第3天起開始增加，在第14天時表達量最高，在第21天和第28天時稍有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。而RanBP9的表達量在術后第7天出現減少(P<0.05)，之后RanBP9的表達量隨著時間的增加而持續下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4A、B。Western blot和免疫熒光實驗結果表明：Cry組RanBP9的表達量隨著手術時間的延長逐漸降低，至第14天后幾乎無RanBP9的表達，在SC組和Con組中RanBP9的表達量豐富且無明顯改變，見圖4C、D。

3 討論

目前全世界范圍內大約有15%的育齡夫婦不能生育，其中男性因素占50%[6]。隱睪作為一種常見的男性生殖系統先天性疾病，可導致精子發生障礙，進而影響男性生育能力。近些年來，越來越多的研究[7]表明miRNAs參與精子發生的過程。Duan et al[1]研究表明miR-210通過靶向結合NR1D2調控精子發生，且證實了miR-210與隱睪的關系，其可作為一種生物學標志物，可用于對隱睪的預測作用。Huang et al[8]的研究表明miR-34c通過靶向結合Nanos2調控精子發生，且miR-34c/Nanos2的異常表達破壞了SSCs自我更新和分化之間的平衡，最終破壞了隱睪睪丸的精子發生。目前關于miRNAs在隱睪中的研究較少。

圖1 隱睪小鼠術后睪丸形態學分析

A：術后不同天數睪丸肉眼觀大體改變；B：術后不同時間段睪丸體質量比；C：術后不同時間段睪丸HE染色 Bar：100 μm；與SC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與Con組比較：##P<0.01，###P<0.001

圖2 miR-101轉染后RanBP9的表達量變化

A：轉染miR-101mimic后miR-101的表達量；B：轉染miR-101 inhibitor后miR-101的表達量；C：轉染miR-101 mimic后RanBP9的表達情況；D：轉染miR-101 inhibitor后RanBP9的表達情況；與NC組比較：***P<0.001；與INC組比較：###P<0.001

圖3 miR-101和RanBP9在隱睪組、SC組和Con組中的表達情況

A：miR-101在各組睪丸中的表達情況；B：RanBP9在各組睪丸中的表達情況；與SC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與Con組比較：#P<0.05，##P<0.01

miRNAs是一類小的非編碼RNA分子(通常長度為19～23個核苷酸)，通過靶向mRNA的3'非翻譯區(3'-UTR)調控轉錄和翻譯效率。研究[9-11]表明，miRNA參與許多生物過程，包括細胞增殖、細胞凋亡和精子發生。miR-101作為一種脊椎動物進化上保守的miRNA，在別的系統中的作用已有很多報道，其表達水平與某些腫瘤的惡性程度、細胞增殖的抑制、集落形成和淋巴結轉移有關[12]。但miRNA在男性生殖系統中的作用尚不是十分清楚。本實驗通過構建小鼠隱睪模型，通過qRT-PCR檢測發現，相較于SC組、Con組、Cry組中miR-101的表達量是升高的，且miR-101隨著時間推移而逐漸增加，這表明miR-101的表達與隱睪是有相關性的。

RanBP9是一種普遍表達的腳手架蛋白，主要分布于細胞核和細胞質，其可與多種蛋白發生相互作用而在多種生物過程中起重要作用，如細胞黏附、細胞增殖、細胞凋亡、遷移和信號轉導等[13]。在生殖細胞中，RanBP9通過與DDX4、種系特異性RNA解旋酶和GASZ(在精母細胞中廣泛表達的生殖細胞蛋白)相互作用而發揮細胞功能，并且對于轉座子抑制是必不可少的[14-15]。研究[3-4]表明RanBP9在精子發生中發揮重要作用，敲除了RanBP9的小鼠出現了嚴重的生精障礙。但RanBP9與隱睪的關系目前尚未見報道。本研究中，通過qRT-PCR、Western blot和免疫熒光實驗證實RanBP9在隱睪中表達量是下降的，其減少可能是隱睪小鼠精子發生障礙的原因之一。

圖4 miR-101和RanBP9在隱睪不同時間段表達情況

A：術后不同時間miR-101的表達情況；B：術后不同時間RanBP9的表達情況；C：術后不同時間RanBP9蛋白的表達情況；D：術后不同時間免疫熒光染色檢測RanBP9表達情況 Bar=40 μm；與術后3 d比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

盡管有研究[5]表明在海馬組織中miR-101可以靶向結合RanBP9并調控其表達，但在生殖系統中，特別是男性睪丸中這種調控關系是否存在尚不能確定，因此進行了小鼠精母細胞系(GC-2)細胞轉染實驗，相較于對照組，轉染miR-101 mimic后GC-2細胞中RanBP9表達量是下降的；相反，轉染miR-101 inhibitor后GC-2細胞中RanBP9的表達量是增加的。結果證實了miR-101和RanBP9在睪丸中也具有調控關系。在隱睪組織進行qRT-PCR分析顯示，隱睪中miR-101表達量是增加的，而RanBP9的表達量是減少的，且它們的增加和減少的發生是同步的。這表明在體內miR-101和RanBP9的調控關系也是存在的。

綜上所述，該研究通過外科手術構建小鼠隱睪模型及一系列相關實驗證實了miR-101在體內體外都參與調控RanBP9的表達，并首次證實了miR-101與隱睪癥的關系。但是該研究仍尚淺，miR-101和RanBP9在隱睪所致精子發生障礙中的具體機制目前仍不明確。及早的診斷與治療對于隱睪患者來說是非常重要的。該研究表明miR-101通過調控RanBP9的表達在隱睪所致男性不育中發揮著重要的作用，miR-101可以作為隱睪癥的一種生物學標志物。