紅景天苷聯合右美托咪定對LPS誘導的人關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應的調節作用

杜 剛，陳 娜，劉曉艷，趙 亮

骨關節炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關節炎或退行性骨關節病，主要表現為關節疼痛、僵硬及活動受限等癥狀[1]。全世界范圍內，OA發病率約為15%，在中老年慢性疾病中位列第2位[2]。軟骨細胞數目及穩定的功能對于維持軟骨穩態、軟骨基質合成和降解平衡有著至關重要的作用。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種高選擇性受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛等多種功效[3]，研究[4]表明Dex還具有抗炎作用。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要活性成分，已有研究[5-6]報道Sal對缺血缺氧心肌以及神經元具有一定保護作用，Sal作用機制與減輕興奮性毒性、拮抗鈣超載及清除細胞內活性氧基團或分子(reactive oxygen species，ROS)等相關。該研究主要探討Sal和Dex聯合用藥在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的人關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應模型中對軟骨細胞的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試劑DMEM細胞培養液、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司；赫斯特(Hoechst)染色 3342染色試劑盒(貨號：ab228551)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinylaspartatespecificproteinase-9，Caspase-9)(貨號：ab32539)、Caspase-3(貨號：ab13847)、BrdU(貨號：ab8955)、二型膠原蛋白(denatured type II collagen，Collagen II)(貨號：ab34712)、聚集蛋白聚糖(貨號：ab3778)、MMP-13(貨號：ab39012)、p65(貨號：ab16502)、p-p65(貨號：ab6503)、GAPDH(貨號：1056)一抗均購自美國abcam公司； LPS(貨號：L2630)購自美國sigma公司；，HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)(貨號：E-EL-R0015c)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)(貨號：E-AB-10698)、IL-1β(貨號：E-EL-M0037c)購自上海博耀有限責任公司。

1.2 儀器PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司。Multiskan GO酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1分離人關節軟骨細胞 手術室無菌條件下，獲取因外傷進行關節置換患者軟骨組織(獲得知情同意)，先后使用0.2%胰蛋白酶、0.2% Ⅱ型膠原酶低糖DMEM溶液、0.2%Ⅱ型膠原酶溶液消化30 min，再加入DMEM培養基(含20%胎牛血清、鏈霉素100 u/ml、青霉素100 u/ml)制成細胞懸液，轉入培養皿中，再置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養，一般4～6 h后軟骨組織塊消化完全。觀察細胞生長情況，每3 d換液。

1.3.2LPS誘導人關節軟骨細胞關節炎及聯合用藥分組 取傳代3次的人關節軟骨細胞，分別設置健康對照組(Ctrl組)、LPS誘導模型組(LPS組)、單用Sal組(LPS+Sal組)、單用Dex組(LPS+Dex組)、Dex聯合Sal組(LPS+Dex+Sal組)。各組模型中LPS刺激8 h(100 ng/ml)，Sal(50 μg/ml)和Dex(100 nmol/l)連續使用48 h。收集細胞備用。

1.3.3Hoechst染色 對藥物處理的細胞培養48 h后進行染色處理：吸盡培養液后加入0.5 ml固定液固定10 min；去除固定液用PBS洗2次，每次3 min；加入0.5 ml Hoechst染色液染色5 min；用PBS洗2次，每次3 min；滴加抗熒光淬滅封片液蓋上蓋玻片熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4免疫熒光染色 操作步驟按照說明書進行，細胞接種于預先用0.01%多聚賴氨酸包被的蓋玻片，經藥物處理后，進入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封閉液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入預溫的封閉液，室溫下封閉1 h；孵育一抗4 ℃過夜。次日，PBS漂洗，孵育熒光標記的二抗(濃度為1 ∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.55-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)檢測細胞增殖 取處理后各組軟骨細胞對6孔細胞板進行鋪板，1×105個/孔。加入BrdU，37 ℃孵育40 min；棄培養液，培養板用PBS洗滌3次，甲醇固定10 min；經過空氣干燥，0.3% H2O2-甲醇30 min滅活內源性氧化酶；5%正常兔血清封閉，甲酰胺100 ℃、5 min變性核酸；冰浴冷卻后PBS洗滌，加一抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1 ∶50)，陰性對照加PBS，Hoechst襯染，在顯微鏡下隨機選擇10個視野，進行參數統計。

1.3.6Western blot檢測細胞中蛋白表達 收集4組細胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解，用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，經5% BSA封閉后依次孵育相應一抗和二抗。顯色并統計灰度值計算相對表達量。

1.3.7ELISA檢測炎癥因子 取各組細胞上清液低溫4 000 r/min離心8 min，取出上清液供實驗使用。加樣：分別設空白孔、標準品待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μl，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。溫育：用封板膜封板后置于37 ℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。溫育：再次用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。洗滌：再次小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。終止：每孔加入50 μl終止液，終止反應(此時藍色立轉為黃色)。測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光值(optical density，OD)。測定在加終止液后15 min內進行。

2 結果

2.1 Sal聯合Dex抑制人關節軟骨細胞凋亡水平Hoechst染色實驗結果表明，Ctrl組軟骨細胞著色較淺、均勻分布，細胞形態均一；與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞核著色較深，數量增多(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞核著色深度有所降低，數量減少(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細胞核著色顯著降低，數量明顯減少(P<0.01)，見圖1。對各組樣品進行Western blot檢測發現，與Ctrl組比較，LPS組Caspase-3和Caspase-9表達量顯著增高(P<0.01)；

圖1 不同處理組軟骨細胞凋亡情況

A：Hoechst染色鑒定細胞凋亡情況×400；B：不同處理組細胞凋亡率統計分析；與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組Caspase-3和Caspase-9表達量明顯減少(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組Caspase-3和Caspase-9表達量則顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 Western blot檢測不同處理組細胞中Caspase-3和Caspase-9表達水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

2.2 Sal聯合Dex促進軟骨細胞增殖BrdU染色實驗顯示，Ctrl組軟骨細胞著色數量較多；與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞著色數量顯著減少(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞著色數量有所增加(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+De組軟骨細胞著色數量增加顯著(P<0.01)。見圖3。

2.3 Sal聯合Dex促進軟骨細胞分泌功能蛋白Western blot實驗顯示，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平顯著降低，基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)表達能力顯著上升(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平有所提高，MMP-13表達量有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+De組軟骨細胞分泌Collagen Ⅱ和軟骨蛋白聚糖水平顯著升高，分泌MMP-13能力顯著下調(P<0.01)。見圖4。

2.4 Sal聯合Dex降低軟骨細胞分泌炎癥因子ELISA檢測細胞樣本中相關炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β結果顯示，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞分泌炎癥因子水平顯著增強(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞分泌炎癥因子水平有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細胞分泌炎癥因子能力顯著下調(P<0.01)，見圖5。

2.5 Sal聯合Dex抑制軟骨細胞中NF-κB p65信號活性為了進一步探究Sal對Dex在人軟骨細胞炎癥中的調節作用，通過免疫熒光技術檢測不同處理組細胞中p65入核情況(使用Hoechst對軟骨細胞進行背景染色)，與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞核幾乎全部為陽性(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞核陽性率有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細胞核陽性率顯著下降(P<0.01)，見圖6。同時，使用Western blot對各組軟骨細胞中核轉錄因κB p65(nuclear transcription factor κB p65，NF-κB p65)激活清況進行檢測。與Ctrl組比較，LPS組軟骨細胞NF-κB p65激活水平顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+Sal組和LPS+Dex組軟骨細胞中NF-κB p65激活情況有所下降(P<0.01)；與LPS+Dex組比較，LPS+Sal+Dex組軟骨細胞中NF-κB p65活性顯著下調(P<0.01)，見圖7。

圖3 BrdU染色檢測軟骨細胞增殖×400

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖4 Western blot檢測顯示軟骨細胞相關蛋白表達水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖5 ELISA法檢測軟骨細胞相關因子表達水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

3 討論

我國傳統藏藥紅景天富含Sal，具有抗衰老、抗氧化應激等藥理作用。Dex除了具有鎮靜、鎮痛等作用外，同時還可以通過激活膽堿能抗炎通路，使單核/巨噬細胞TNF-α等炎癥因子的合成、釋放明顯減少，從而抑制全身過度炎癥反應[7]。Luo et al[8]研究證實，在非小細胞肺癌A549細胞系中，Dex可以通過降低C/EBP同源蛋白信號通路的活性來抑制凋亡的發生；而Wang et al[9]同樣在A549細胞中證明Dex可以通過α2-腎上腺素能受體來激活抗凋亡的通路，抑制凋亡的發生。有實驗報道稱OA軟骨氧濃度明顯低于正常軟骨，低氧環境又促進缺氧誘導因子-1α( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)表達水平上調[10]。HIF-1α可以激活TGF-β1分子[11]以活化纖維蛋白溶酶原(plasminogen activator, PA)來減少膠原蛋白合成；通過PA誘導TNF-α上調，激活下游Caspase-3和MMP-13通路[12]；上調MMP抑制因子1表達從而降解下游靶蛋白以減少軟骨細胞內膠原蛋白合成[13]。本研究結果證明，LPS誘導的人關節軟骨細胞產生大量炎癥因子IL-6、TNF-α等。對LPS+Dex組軟骨細胞進行Sal聯合Dex處理后，細胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β等減少，并且細胞內Caspase-3和Caspase-9都發生明顯降低，并且還促進軟骨細胞的增殖比例。同時也檢測到Collagen Ⅱ和Aggrecan蛋白分泌增加，MMP-13分泌顯著下調。表明Sal可以促進Dex對軟骨細胞功能改善，可以有效抑制軟骨細胞凋亡，同時還可以促進細胞增殖速率。

圖6 各處理NF-κB p65表達定位及活性

A：免疫熒光檢測各處理組NF-κB p65表達定位及活性×400；B：免疫熒光檢測各處理組NF-κB p65表達結果統計分析；與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

圖7 Western blot檢測各處理組NF-κB p65表達水平

與Ctrl組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01；與LPS+Dex組比較：△△P<0.01

TGF-β信號分子在多種重要信號途徑中參與多細胞應答，如細胞增殖、分裂、凋亡、免疫及驗證應答等[14]。TGF-β1一方面降低p-NF-κB p65和TNF-α活性來降低炎癥因子IL-6、IL-17等來抑制免疫炎癥[15]，另一方面還可以結合TNF-α共同抑制Caspase-3依賴的凋亡通路來抑制凋亡發生。實驗結果表明，正常組軟骨細胞p-p65和TNF-α表達水平較低，且p-NF-κB p65極少入核；經過LPS誘導之后兩者水平顯著升高，p-NF-κB p65大量進入細胞核，Dex雖然可以有效降低二者表達水平，但是在經過Sal處理后細胞p-NF-κB p65和TNF-α等表達水平進一步降低，p-NF-κB p65入核現象也得到明顯改善。說明Sal可以有效促進Dex對細胞內NF-κB p65激活，并且進一步影響下游相關基因的表達。