細胞間隧道納米管介導的線粒體轉運誘導急性單核細胞白血病細胞抵抗凋亡的研究

徐前飛，劉亞蒙，周 震，田志祥，王麗紅，胡 艷，李 靜，劉曉穎，葛 健

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的特點是白血病細胞浸潤骨髓、異常增殖和分化受阻。有50%～75%的患者對誘導化療敏感而達到緩解，但大多數會復發，只有30%～40%的患者能實現長期生存[1]，白血病細胞不能完全被藥物殺滅可能與高水平的藥物外排泵、有效的DNA修復以及環境介導耐藥等有關[2]。腫瘤微環境中細胞間生物信息交換存在多種方式，主要通過縫隙連接、整合素蛋白、四硫蛋白、鈣粘素、細胞因子、胞外囊泡等介導[3-4]。最近研究[5]發現一種新的細胞間相互作用方式—隧道納米管(tunneling nanotubes，TNTs)或者叫膜納米管，這些長管狀結構主要由肌動蛋白和微管、微絲組成，直徑在50～1 500 nm，長度可以跨越幾十到數百微米，將不同細胞的質膜和胞質連接在一起，從而實現將不同細胞成分從一個細胞轉運到另一個細胞，完成生物信息的直接交換。進一步研究發現細胞間TNTs能夠傳遞包括細胞器、病原體、膜結合蛋白等[6-9]多種物質。該研究通過模擬骨髓微環境，建立體外共培養體系鑒定骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSCs)與急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞間TNTs結構，觀察TNTs中線粒體的轉運及其對THP-1細胞凋亡的影響，并探索細胞間線粒體轉運的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 骨髓均來自安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科，征得患者同意，所有實驗者均簽署知情同意書，骨髓結果明確診斷非白血病及其他血液系統惡性疾病。THP-1細胞購自上海中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 纖連蛋白(北京索萊寶公司)；MitoTracker Red CMXRos(美國Invitrogen公司)；Transwell小室3 μm(美國Corning公司)；Latrunculin B(美國APExBIO公司)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海貝博公司)；共聚焦顯微鏡LEICA.APA_DMI6000_DIC(德國徠卡公司)；DMEM培養基、RPMI-1640培養基、FBS、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Ficoll細胞分離液(天津TBD公司)；Actin-Tracker Green 、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)；CD45-APC抗體(美國Biolegend公司)；山羊抗兔生物素二抗(北京中杉金橋有限公司)；KIF5B單克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 THP-1細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素的RMPI-1640培養基于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。

1.2.2BM-MSCs的分離、培養 肝素化骨髓取50 U/ml肝素抗凝的骨髓5 ml，加入等體積PBS細胞吹打混勻，室溫1 500 r/min離心10 min，去掉脂肪層，用PBS重懸細胞，緩慢注入等體積的1.073 g/ml Percoll分離液，2 000 r/min離心20 min，吸取中間的單個核細胞層，PBS清洗2次，重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，將細胞按1×106/ml接種于培養瓶中，37 ℃培養箱培養，24 h后首次換液，以后2～3 d換液1次。待原代細胞增殖至鋪滿瓶底時，在0.25%胰蛋白酶消化以后以1×104/cm2接種在培養瓶中，實驗中所用的間充質干細胞均為第3～5代。

1.2.3細胞爬片的制備 取干凈的蓋玻片清洗干凈，浸泡在硫酸重鉻酸鉀溶液48 h后取出，自來水沖洗干凈，雙蒸水沖洗3次，高壓滅菌備用。準備濃度為10 μg/ml纖維連接蛋白浸泡的蓋玻片，于超凈臺中晾干后置于6孔板中；線粒體特異性探針MitoTracker Red CMXRos用無血清培養基稀釋至250 nmol/L，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育BM-MSCs(THP-1)30 min，PBS洗3次，用含10%胎牛血清的DMEM(1640)培養24 h，BM-MSCs配制成5×104/ml細胞懸液接種到有蓋玻片的孔中，待貼壁后吸去培養基，用5%FBS的1640將處于對數生長期的 THP-1細胞濃度調至1×106/ml加入到接種了BM-MSCs的孔中，共培養24 h。

1.2.4細胞爬片的染色與熒光成像 將細胞爬片從培養皿中取出，用PBS溶液洗滌3次，滴加4%甲醛溶液于細胞爬片上，劑量為覆蓋爬片為準，室溫固定細胞10 min，PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加稀釋度為1 ∶100的Actin Tracker Green(Ex 496 nm，Em 516 nm)溶液于爬片上，每片200 μl，室溫避光孵育40 min，PBS溶液洗滌同上；滴加200 μl DAPI(Ex 405 nm，Em 420 nm)于爬片上對細胞核復染，室溫避光約2 min，封片劑DAKO封片；MitoTracker Red CMXRos(Ex 579 nm，Em 599 nm)，于共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號分布并采集圖像。

1.2.5THP-1細胞凋亡的Annexin V/PI熒光標記法檢測 將P3-P5代BM-MSCs以5×104/孔接種于24孔板中，待細胞完全貼壁后，棄去培養液，取對數生長期的THP-1細胞，用10%FBS的1640重懸，以細胞密度為1×106接種于相應的孔中，共培養體系包括BM-MSCs與THP-1細胞直接共培養(SC組)、間隔Transwell透膜(物理阻斷TNTs)共培養(TC組)、直接共培養體系中加入細胞松弛素Latrunculin B(TNTs抑制劑)1.25 μmol/L(LC組)、無BM-MSCs而僅有培養液(MC組)四組，共培養5 d。SC、LC組用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化、收集細胞，離心棄上清液，PBS清洗兩次，用95 μl PBS重懸，加入CD45-APC抗體5 μl，避光孵20 min，離心棄上清液，再用400 μl Annexin V結合液懸浮細胞，先后加入Annexin V-FITC 5 μl、Propidium lodide10 μl，分別避光孵育15 min、5 min，進行流式細胞儀檢測。采用Flowjo 7.6軟件分析。

1.2.6Western blot檢測蛋白的表達 用100 nmol/L Rotenone(線粒體特異性抑制劑)處理BM-MSCs 24 h或48 h；各組細胞加入蛋白酶抑制劑和裂解液的混合物，在冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，用BCA法檢測蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，80 V(濃縮膠)/120 V(分離膠)電壓對蛋白質進行分離，在100 V恒壓條件下轉移1.5 h。PVDF膜用TBST沖洗并浸入5%脫脂牛奶中封閉，震蕩1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，一抗(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶2 500)室溫孵育1 h，ECL化學發光顯像。

2 結果

2.1 鑒定BM-MSCs和THP-1細胞之間TNTs共聚焦顯微鏡下觀察到BM-MSCs與THP-1細胞間有長管狀結構形成，用熒光染料Actin-Tracker Green特異性染色，顯微鏡下發現這些長管狀結構表達細胞骨架蛋白F-actin，提示這些管狀結構即為TNTs，見圖1。

圖1 共聚焦顯微鏡下BM-MSCs與THP-1細胞間形成TNTs ×400

A：F-actin；B：細胞核；C：疊加效果; 白色箭頭指的是細胞間TNTs結構

2.2 觀察BM-MSCs和THP-1細胞間線粒體通過TNTs轉運用Mitotracker Red CMXRos特異性標記線粒體，實驗分為兩組：BMSCs(MitoTracker)+THP-1、BMSCs+THP-1(MitoTracker)，在標準條件下共培養24 h后制片，并用共聚焦顯微鏡觀察。在顯微鏡下觀察到被熒光標記的BM-MSCs線粒體通過TNTs轉運到THP-1細胞中，見圖2A；并未觀察到THP-1細胞線粒體通過TNTs向BM-MSCs轉運，見圖 2B；說明線粒體是從BM-MSCs向THP-1細胞單向轉運的。

2.3 流式細胞術檢測各組THP-1細胞凋亡率THP-1細胞與BM-MSCs共培養5 d后各組凋亡率比較，SC組、LC組、TC組及MC組凋亡率分別為(7.45±2.62)%、(24.03±2.3%)%、(58.34±5.73)%、(61.37±2.78)%，SC組及LC組凋亡率較MC組明顯減低(P<0.01)，且LC組較SC組凋亡率增高(P<0.01)，提示直接共培養后THP-1細胞凋亡率減低；與SC組比較，加入TNTs抑制劑Latrunculin B(破壞部分TNTs結構，阻礙線粒體傳遞)后THP-1細胞凋亡率有所增高，提示直接共培養后THP-1細胞凋亡率下降可能與TNTs形成有關；TC組凋亡率較SC組及LC組明顯增高(P<0.01)，TC組與MC組凋亡率無差異(P>0.05)；Transwell透膜物理阻斷TNTs后(TC組)THP-1細胞凋亡率增高，而與THP-1細胞單獨培養凋亡率無明顯差異，進一步提示THP-1細胞凋亡率下降可能是由TNTs介導，而TNTs中線粒體的轉運可能是其重要的組成部分。各組間差異有統計學意義(F=69.97，P<0.01)，見圖3。

2.4 Western blot檢測KIF5B的表達水平BM-MSCs經魚藤酮(Rotenone)分別處理24、48 h后，與對照組比較，KIF5B蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，且BM-MSCs中KIF5B表達水平明顯高于THP-1細胞(P<0.001)，見圖4。

圖2 共聚焦顯微鏡下各組細胞間TNTs中線粒體的轉運 ×400

A：BMSCs(MitoTracker)+THP-1；B：BMSCs+THP-1(MitoTracker)；Actin-Tracker Green：細胞骨架F-actin；Mitotracker Red CMXRos：線粒體；DAPI：細胞核；Merge：疊加效果及局部放大后圖片；白色箭頭指的是沿TNTs轉運的線粒體

圖3 流式細胞術檢測THP-1細胞凋亡

A：各組細胞流式細胞術檢測結果；B：各組細胞凋亡率；與MC組比較：**P<0.01；與TC組比較：##P<0.01；與SC組比較：▽▽P<0.01

圖4 Western blot法檢測KIF5B蛋白表達情況

A：KIF5B(BM-MSCs)；1：Control組；2：Rotenone處理24 h組；3：Rotenone 處理48 h組；與Control組比較：**P<0.01；B：KIF5B(BM-MSCs-THP-1)；4：BM-MSCs組；5：THP-1組；與BM-MSCs組比較：###P<0.001

3 討論

通過模擬骨髓微環境建立共培養體系，本研究表明BM-MSCs與THP-1細胞間能夠遠距離形成TNTs。以往研究[10]認為F-actin的表達是TNTs的特異性標志，本研究通過Actin-Tracker Green特異性標記F-actin，共聚焦顯微鏡下觀察到BM-MSCs與THP-1細胞間TNTs中存在F-actin。有研究[11]證實親脂性染料DiO、DiI可以通過TNTs雙向傳遞。線粒體是調節細胞能量水平、代謝和凋亡的重要細胞器，可影響細胞增殖和分化。近年來，研究[12]證明線粒體產生的ATP和線粒體局部代謝途徑在AML的進展中起著重要作用。本研究使用熒光標記追蹤線粒體的方法證明線粒體可以通過TNTs轉運，并且發現線粒體只能由BM-MSCs向THP-1細胞單向轉運，而沒有觀察到線粒體從THP-1細胞延著TNTs向BM-MSCs轉運。線粒體只能單向傳遞的機制尚不明確，Brickley et al[13]研究認為神經元內線粒體轉運可能與Miro1、Miro2、TRAK1、KHC等蛋白相關；Babenko et al[14]研究表明Miro1可以促進線粒體從MSCs向神經細胞轉運。Ahmad et al[15]研究發現Rotenone是一種特異性線粒體抑制劑，可以有效抑制BM-MSCs線粒體向內皮細胞傳遞。本研究用Rotenone誘導BM-MSCs，檢測Rotenone誘導前、后BM-MSCs馬達蛋白KIF5B的表達水平，發現Rotenone處理后KIF5B表達顯著下降。并發現KIF5B在BM-MSCs中表達明顯高于THP-1細胞，這符合濃度梯度動力學模型[15]，這提示 KIF5B可能參與細胞間線粒體轉運。

本實驗同時研究了共培養系統中線粒體單向傳遞對THP-1細胞凋亡的影響，Transwell透膜組THP-1細胞凋亡率較直接共培養組明顯增高，而與THP-1單獨培養組凋亡率無明顯差異；Transwell透膜通過物理阻斷細胞間TNTs，切斷線粒體傳遞，而不影響細胞因子及胞外囊泡的作用，這提示直接共培養組THP-1細胞凋亡下降可能主要受細胞間TNTs中線粒體轉運影響；加入TNTs抑制劑Latrunculin B可以破壞一部分TNTs結構，阻礙部分線粒體傳遞，這可能與加入Latrunculin B組THP-1細胞凋亡率較直接共培養組增高有關。