Caspase-1及其相關炎癥因子在二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌形成過程中的變化及意義

楊 琪，卓少元

肝癌是目前臨床常見難治的惡性腫瘤，其國內發病率與死亡率分別位居惡性腫瘤第四位和第二位[1]。肝癌發病機制非常復雜，但促進腫瘤的炎癥是目前公認的腫瘤十大特征之一[2]，慢性肝臟炎癥在肝癌的發生發展及轉移過程中具有至關重要的推動作用[3-4]。Caspase-1是第一個在哺乳動物中被發現的半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine containing aspartate specific protease, Caspase)，其在多種炎癥反應中具有核心調控作用[5]。該研究采用腹腔注射二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)的方式來誘導大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型，旨在探討Caspase-1及其相關炎癥因子白細胞介素 1β (interleukin-1β, IL-1β)、IL-18、核因子-κB (nuclear factor κB, NF-κB)在DEN誘導大鼠肝癌形成過程中的變化及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠 42 只，SPF級，體質量(140±20)g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，生產許可證號SCXK桂2014-0002，使用許可證號SYXK桂2014-0003。

1.2 實驗試劑DEN購自美國Sigma公司，貨號N0756-10ML；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase, AST)測定試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司，貨號分別為C002-a、C001-a；α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase, AFU)和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，貨號分別為E008、C017；大鼠Caspase-1活性測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，貨號BC3810；大鼠IL-1β、IL-18和NF-κB酶聯免疫吸附測定試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號分別為E-EL-R0012c、E-EL-R2426c、E-EL-R0674c。

1.3 主要儀器Chemray全自動生化分析儀購自美國Rayto公司；Epoch Biotek全波長酶標儀購自美國Biotek公司；DMI3000B研究型倒置顯微鏡購自德國Leica公司；ST 16R高速離心機購自美國Thermo Fisher Sorvall Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1動物造模 實驗大鼠共42只，適應性飼養1周后(溫度為21～23 ℃，濕度50%)，隨機分為正常對照組(6只)和模型組(36只)，其中模型組按照70 mg/kg體質量給予腹腔注射DEN，每周1次，連續注射10周。

1.4.2標本采集及處理 造模第 0 周隨機抽取正常組動物3只，及造模第6、13、20周最后1天隨機抽取模型組動物3只，分別用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，常規制備血清并分裝后于-80 ℃ 保存備用。之后迅速取其完整肝臟、脾臟和胸腺組織標本，計算肝、脾和胸腺指數：臟器指數(%)=臟器濕重(g)/體質量(g)×100%。

1.4.3肝臟組織形態學觀察 在各組大鼠肝臟同一部位取組織一塊，4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片脫蠟，HE染色，脫水封片，光鏡下觀察。

1.4.4血清指標檢測 采用可見分光光度法檢測各組大鼠血清中ALT、AST、GGT和AFU的含量；采用ELISA法檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-18和NF-κB水平。以上步驟均嚴格按照相關試劑盒說明書操作。

1.4.5肝臟(或肝癌)組織Caspase-1活性檢測 組織加裂解液勻漿后離心取上清液，用Bradford法測定蛋白濃度，使蛋白濃度達到1～3 mg/ml。按照Caspase-1活性測定試劑盒說明書操作，于405 nm波長檢測光密度(optical density，OD)值，計算Caspase-1活性，Caspase-1活性百分比=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2 結果

2.1 一般情況比較模型組大鼠在造模前期，進食進水量和正常組相差不大，從造模第5周開始進食進水量都明顯下降，精神萎靡活動量減少，且開始暴躁；第9周開始有大鼠死亡，至造模結束共有7只大鼠死亡，解剖發現腹腔積水且胃腸道透明，其余大鼠在第20周均已致癌。正常組(第0周)大鼠肝臟形態正常，顏色鮮紅，質地柔軟，表面光滑無任何異常，見圖1A；造模第6周大鼠肝臟與第0周比較，除顏色稍深之外，無明顯的異常表現，見圖1B；造模第13周大鼠肝臟表面逐漸粗糙，出現數量不等、大小不一的灰白色近圓形病灶，直徑大多1 mm以下，呈彌散分布，見圖1C；造模20周時，大鼠肝臟表面非常粗糙，出現多個大小不一的灰白色結節，部分大鼠腹腔有黃色腹水，肝臟與周圍器官黏連嚴重，可見出血和壞死，見圖1D。在造模過程中，大鼠體質量呈逐漸上升趨勢。與正常組(第0周)大鼠比較，造模第6周大鼠肝臟、脾臟和胸腺指數均下降；隨著造模進程，肝臟指數和脾臟指數逐漸增加；而胸腺指數逐漸下降，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01)，表明DEN對臟器具有一定的毒性，大鼠免疫功能被抑制。見表1。

圖1 DEN誘導癌過程中大鼠肝臟形態變化

時間點體質量(g)肝臟指數脾臟指數胸腺指數第0周163±16296.69±9.2532.39±4.9120.12±10.37第6周338±27271.07±8.6417.66±2.6810.15±6.23第13周420±39388.26±12.1227.12±4.096.67±4.76第20周428±44552.65±17.41**43.53±6.613.06±2.18**

與第0周比較：**P<0.01

2.2 肝臟組織病理學比較正常組(第0周)大鼠肝細胞完整，在肝小葉中央靜脈周圍呈放射狀排列。造模第6周大鼠肝細胞腫脹，表現為彌漫性肝細胞水腫，部分肝細胞呈嗜酸性變；肝小葉結構尚完整，小葉內可見灶性壞死伴炎性細胞浸潤。造模第13周大鼠肝細胞水腫進一步加重，可見不同程度的小泡性脂肪變性；出現嗜酸性或透明細胞增生灶，可見典型假小葉形成。造模第20周大鼠肝細胞可見不同程度的脂肪變性，肝癌細胞成團塊狀，部分有出血和壞死，并伴有肝細胞增生灶和結節。見圖2。

2.3 大鼠血清生化指標含量變化血清ALT、AST、GGT、AFU的含量均隨著造模進程逐漸升高。與正常組(第0周)比較，血清ALT、AST和GGT含量在造模第13周差異有統計學意義(P<0.01)，第20周表現則更加明顯；血清AFU含量在造模第20周差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。提示大鼠肝功能在造模過程中逐漸惡化。

2.4 大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量變化血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均隨著造模進程逐漸升高。與正常組(第 0 周)比較，造模第 6 周大鼠血清IL-1β含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)，NF-κB含量升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；造模第13周大鼠血清IL-1β、NF-κB含量明顯升高(P<0.01)；造模第20周鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量最高(P<0.01)。見表3。

2.5 大鼠肝臟(或肝癌)組織中Caspase-1活性變化大鼠肝臟組織中Caspase-1活性隨著造模進程逐漸升高。與正常組(第0周)比較，造模第6周大鼠肝組織中Caspase-1活性升高(P<0.05)，造模第13周差異有統計學意義(P<0.01)，至造模第20周活性達到最高(P<0.01)。造模第 20 周時，與大鼠肝臟(含肝癌)組織比較，癌旁正常肝組織中Caspase-1活性幾乎沒有差別；但肝癌組織內Caspase-1活性卻顯著降低，甚至低于造模第6周的肝組織。見表4。

表2 造模不同時期大鼠血清生化指標含量變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 大鼠血清中IL-1β、IL-18和NF-κB含量變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 造模不同時期大鼠肝臟組織病理學比較

表4 大鼠肝臟組織中Caspase-1活性變化

與第0周比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

人類原發性肝癌的發生是一個多種誘因、多階段的過程，要經歷肝炎-肝硬化-肝癌的過程。而現代研究證實，DEN是一種具有遺傳毒性的化學物質，具有肝毒性，可致基因突變、畸形，還可誘導肺、肝、血液系統多種腫瘤的形成，應用DEN制作肝癌前病變模型具有階段性特征。湯靚[6]的研究表明DEN誘導大鼠肝癌模型有明顯的三個病程：炎癥期(1～8周)、硬化期(9～15周)及肝癌期(16～20周)，與人類原發性肝癌的發展過程及病理形態學變化等均非常相似。通過一般觀察、肝臟組織病理學比較，以及血清生化指標分析等結果，證實本實驗成功復制了該肝癌模型。

本研究分別選取了第0周(正常)、第 6 周(炎癥期)、第13周(硬化期)和第20周(肝癌期)進行相關炎癥因子研究。結果顯示，血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量均隨著造模進程逐漸升高，且在造模第20周(肝癌期)達到最高，提示這些炎癥因子在DEN誘導大鼠肝癌形成過程中可能發揮著非常重要的作用，可作為反映DEN誘導肝癌發生發展過程肝細胞損傷程度的標志因子。

IL-1β和IL-18在細胞內主要由Caspase-1切割白細胞介素1β前體(precursor of interleukin-1β，pro-IL-1β)和pro-IL-18產生；當危險信號來臨時，pro-Caspase-1通過核苷酸結合寡聚化結構域核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(nucleotide binging and oligomerization domain-like receptors 1，NLRP1)、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子等多種炎性小體感受器蛋白，及銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)的作用被激活，成為pro-IL-1β和pro-IL-18成熟的工具酶[5]。NF-κB是炎癥致癌過程中主要的調節因子，研究[7]表明NF-κB在原發性肝細胞癌組織中表達增強，且與癌組織的分化程度、有無淋巴結轉移、患者甲胎蛋白水平等呈正相關。除此之外，pro-Caspase-1可以利用其半胱天冬酶募集結構域直接與受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)相互作用，誘導RIP2依賴的NF-κB激活；與pro-IL-1β、pro-IL-18成熟不同，NF-κB的激活不需要依賴Caspase-1酶的裂解活性[8]，而且活化后的IL-1還可利用其受體IL-1R1激活NF-κB[9]。這表明IL-1β、IL-18和NF-κB均可作為Caspase-1的效應分子在炎癥反應中發揮重要作用。本研究也證實大鼠肝臟組織中Caspase-1活性隨著造模進程逐漸升高，其表達趨勢與血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量一致。

值得注意的是，造模第20周肝癌形成后，Caspase-1活性在大鼠肝臟(含肝癌)組織和癌旁正常肝組織中幾乎沒有差別，但在肝癌組織內卻顯著降低，甚至低于造模第 6 周的肝組織，提示造模第20周大鼠肝臟(含肝癌)組織中Caspase-1活性主要源于癌旁正常肝組織。這一結果與Wei et al[10]對臨床肝炎、肝硬化、肝癌患者的研究類似：Caspase-1及其相關炎性小體組分在正常肝組織表達水平相對較低，肝損傷(如肝炎、肝硬化)時表達量明顯上調；與癌旁正常肝組織相比，其在肝癌實質細胞中的表達明顯下調。其原因可能在于：在肝癌發生發展過程中，一方面，以Caspase-1為核心的炎性小體在細胞內激活，通過誘導細胞死亡以消除有癌變傾向的細胞；另一方面，炎性小體效應分子IL-1β、IL-18等的裂解與釋放可能在腫瘤微環境中引發炎癥循環，導致無菌性炎癥和癌癥發生[5,11]。

劉錢[12]的研究也表明當肝臟存在炎癥時，肝實質細胞內Caspase-1的表達會增強；但在相同條件下，Caspase-1在肝癌細胞內的上調水平要明顯高于正常肝細胞。Caspase-1作為一種重要的炎癥相關分子，可以通過多種方式參與腫瘤炎癥微環境調控，其在腫瘤中的作用正如Zitvogel et al[11]所述：“在惡性腫瘤細胞與其微環境相互作用過程中，Caspase-1的激活扮演著雙面角色：積極誘導腫瘤細胞程序性死亡和抗腫瘤的免疫監視，但同時也通過刺激自分泌或旁分泌，促進致癌性炎癥及腫瘤的生長與轉移”。