LncRNA XIST在急性髓系白血病中的表達及其臨床意義

劉 軍，鄭慧敏，丁洋洋，李曼曼，胡林輝，蒲蓮芳，陶千山，熊術道

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類髓系造血干祖細胞的惡性克隆性疾病，是成人白血病中最常見的一種類型[1]。盡管大多數的AML患者在接受化療后能夠達到完全緩解，但AML患者的總體5年生存率仍然很差，約為30%～40%[2]。因此，仍需對 AML發生發展的機制及預后因素進行深入研究。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度大于200 bp、不具有或者很少具有編碼蛋白質功能的RNA[3]，其不僅參與了機體細胞正常的生理過程，還參與了腫瘤發生發展的病理過程[4]。近年來，越來越多的功能性LncRNAs逐漸被發現且已成為研究的熱點。研究[5-6]表明X染色體失活特異性轉錄因子(X inactive specific transcript，XIST)LncRNA在多種腫瘤，比如胃癌、結腸癌及食管癌等可以促進腫瘤的發生發展。在血液腫瘤中，XIST的研究極少，有研究[7]表明XIST在小鼠血液腫瘤中起到抑癌作用。然而，其在人類AML中的作用尚不明確。該研究旨在探討 LncRNA XIST在人類AML患者骨髓標本中的表達水平及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年5月～2018年11月在安徽醫科大學第二附屬醫院血液科及兒科血液病區經國際上通用的是細胞形態學(morphology)、免疫學(immunology)、細胞遺傳學(cytogenetics)和分子生物學(molecular biology)分型，即常說的MICM分型確診105例初診的AML患者為研究對象(AML組)，其中男57例，女48例，年齡0～84歲，中位年齡49歲，其中兒童18例，成人87例；經法國(Franch)、美國(American)和英國(Britain)等3國血細胞形態學專家討論和制訂了關于急性白血病的分型診斷標準，即為FAB分型。據此標準將急性非淋巴細胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia，ANLL)分成M0-M7共8個亞型，其中急性髓細胞白血病微分化型(M0)2例、急性原始粒細胞白血病未成熟型(M1)5例、急性原始粒細胞白血病部分成熟型(M2)41例、急性早幼粒細胞白血病(M3)21例、急性粒-單核細胞型白血病(M4)17例、急性單核細胞白血病(M5)17例和急性巨核細胞白血病(M7)2例。收集2016年5月～2018年11月在安徽醫科大學第二附屬醫院血液科及兒科血液病區經MICM分型確診20例且化療達到完全緩解(complete remission，CR)AML患者(AML-CR組)，其中男8例，女12例，年齡11～80歲，中位年齡41歲。同期選擇性別與年齡相符，且符合缺鐵性貧血(iron-deficiency anemia, IDA)國際標準的IDA 患者20 例作為對照組(control,CON)。所有入組者所留取的標本均為骨髓。所有入選者均簽署知情同意書；本研究經我院倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑和設備RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；總RNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermofisher公司；Real-Time PCR(SYBGreen)試劑盒購自日本Takara公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和LncRNA XIST 上下游引物購自上海生工生物工程股份有限公司；天隆TL988熒光定量PCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.3 樣本收集、RNA提取及逆轉錄應用EDTA 抗凝管收集對照組(CON)、初治AML組(AML)和化療后達完全緩解組(AML-CR)患者骨髓液2 ml，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后1 500 r/min離心5 min，棄上清液后加入1 ml TRIzol充分吹打細胞沉淀，移至1.5 ml EP管中，標記保存于-80 ℃，通過經典吸附柱法，按照說明書所述，抽提留存的骨髓標本中的總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，逆轉錄待用。采用美國Thermofisher公司的RT試劑盒按其說明書步驟配置反應體系，在普通PCR儀提前設置好的反應條件下將RNA逆轉錄cDNA，-20 ℃保存。

1.4 引物設計與合成在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找LncRNA XIST基因序列，由上海生工生物工程公司設計并合成正反向引物，引物序列見表1。GAPDH 基因序列參照文獻[8]由上海生工生物工程公司合成。

1.5 qRT-PCR按照Real-Time PCR(SYBGreen)試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(購自日本Takara公司)說明書操作，以cDNA為模板，反應體系為20 μl，加入反應試劑進行qPCR反應。反應體系包括：模板 cDNA 2 μl、 SYBR 10 μl、GAPDH或者LncRNA XIST的正反向引物各0.8 μl、加無菌蒸餾水至總反應體積20 μl。qPCR反應條件：95 ℃、 30 s預變性；之后95 ℃變性5 s、60 ℃延伸30 s，共計完成45個循環。每個樣品均設2個復孔，PCR擴增結束后可獲取擴增循環數(cycle threshold，CT)值，以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA XIST的相對表達量。

表1 LncRNA XIST 和GAPDH的引物序列

1.6 統計學處理采用GraphPad Prism 6.01和SPSS 19.0進行統計分析。采用配對t檢驗分析配對組間LncRNA XIST表達量的差異。采用四格表χ2檢驗判斷LncRNA XIST表達量與臨床特征的相關性。采用Kaplan-Meier 方法和Log-rank檢驗分析 LncRNA XIST表達量與AML患者總生存期之間的關系，進一步通過 COX比例風險模型分析不同臨床特征和LncRNA XIST表達量對AML患者預后影響因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA XIST在AML患者骨髓標本中的表達情況qRT-PCR法檢測LncRNA XIST在 105 例初治AML患者(AML) 和20例 AML-CR及20例IDA患者(CON)中的表達。結果顯示，LncRNA XIST在AML患者中的表達量較AML-CR及IDA (CON)患者明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，而LncRNA XIST在20例 AML-CR組患者與20例對照組患者中的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1A。另外，LncRNA XIST在20例AML初治(AML)患者中的表達量與這20例患者化療達到完全緩解后相比較明顯減低(AML-CR)(n=20)，差異有統計學意義(P<0.001)。見圖1B。

2.2 LncRNA XIST的表達水平與AML患者臨床特征的相關性初治AML組中，以LncRNA XIST相對表達量2-ΔΔCt值的中位數為界將AML患者分為高表達組、低表達組，其中高表達組55例、低表達組50例；根據性別、患者年齡中位數、AML分型(M2-M3/M4-M5)、美國國家綜合癌癥網絡(national comprehensive cancer network， NCCN)分級、有無髓外浸潤、骨髓原始細胞比例、白細胞水平及乳酸脫氫酶中位數等將患者分為兩組。分別列出四格表，進行χ2檢驗。結果顯示LncRNA XIST表達水平和患者性別、年齡、NCCN分級、化療2周期達完全緩解、骨髓原始細胞比例、血紅蛋白和血小板水平及白球比無關，但與AML分型(M2-M3/M4-M5)、有無髓外浸潤、白細胞數及乳酸脫氫酶水平有相關性(P<0.05 )。見表2。

圖1 AML中LncRNA XIST的表達水平

A：CON組、 AML組和AML-CR組骨髓標本中LncRNA XIST相對表達量的比較； 與對照組(CON) 比較：***P<0.001；與AML完全緩解組(AML-CR)比較：***P<0.001；B：AML組和AML-CR組骨髓標本中LncRNA XIST相對表達量比較；與AML初治組(AML)比較：***P<0.001

2.3 LncRNA XIST的表達水平與AML患者總生存時間關系及其預后影響因素分析對納入研究的所有105例初治AML組的患者進行了常規隨訪，隨訪期內死亡35例(33.3%)。初治AML組中，以LncRNA XIST相對表達量將AML患者分為高表達組和低表達組，采用Kaplan-Meier法和Log-rank 檢驗比較兩組AML患者的生存率，生存曲線見圖2。結果顯示低表達組的生存時間(0.03～30.9)個月，中位時間8.6個月，低表達組隨訪期生存率(35.5%)明顯低于高表達組(70.8%)(P<0.05)。進一步采用COX多因素回歸分析進行獨立預后影響因素價值的判斷，結果顯示白球比和LncRNA XIST的表達是影響AML患者獨立的預后因素(HR=0.029，95%CI：0.002～0.415，P=0.009；HR=0.052，95%CI：0.003～0.915，P=0.043)。見表3。

表2 LncRNA XIST的表達水平與AML患者臨床特征的相關性

圖2 LncRNA XIST的表達水平與AML患者總生存時間的關系

表3 多因素COX回歸分析AML患者的獨立預后因素

3 討論

AML是一種髓系造血干/祖細胞異常克隆的高度異質性造血系統惡性腫瘤，其病因和發病機制極其復雜[9]。現在普遍認為該病主要是遺傳因素、化學因素、電離輻射、環境因素等多種致病因素協同作用的結果[10]。

近年來，隨著對LncRNA功能和機制的不斷研究發現，LncRNA在多種疾病的發生發展過程中均起到了重要的調控作用。研究[11]顯示，LncRNA通過參與腫瘤的細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲以及遷移等多種生物學進程，從而在腫瘤的發生和發展過程中發揮促癌或抑癌作用。例如，LncRNA 結腸癌相關轉錄物作為一種競爭性內源性RNA調節急性髓系白血病細胞的生長和分化[12]。過表達細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A啟動子反義DNA損傷激活RNA可預測AML的不良預后[13]。本研究中的LncRNA XIST最初發現于1991年人類細胞中，位于X染色體X滅活中心，通過參與介導X染色體沉默來發揮功能。后續大量研究[5-6]表明，XIST在多種實體腫瘤中表達是明顯上調的，且與腫瘤的大小、有無遠期轉移、腫瘤的分期及預后都具有相關性，可作為腫瘤標志物用于腫瘤的診斷及影響腫瘤的預后。同樣XIST在卵巢癌中也發揮了促癌基因的作用參與腫瘤的發生發展，而在乳腺癌中XIST既有高表達也有低表達的研究報道，這可能與乳腺癌及卵巢癌的抑癌基因乳腺癌1號基因有很大關聯[14]。本研究首次利用qRT-PCR檢測LncRNA XIST在AML患者中的表達水平，結果顯示LncRNA XIST在初治的AML患者的骨髓標本中的表達明顯下調，化療完全緩解后明顯上調并與IDA對照組相比差異無統計學意義。本研究結果與XIST在多種實體腫瘤中高表達是有所不同的，但與XIST在乳腺癌中低表達的報道較一致，由此提示XIST的表達與腫瘤的類型及形態的差異可能是有關的，但還需擴大實驗進一步驗證。

目前有關LncRNA XIST的研究大多報道于實體腫瘤中，而在血液腫瘤中的研究罕見報道。有研究[7]表明在小鼠動物模型中敲除XIST導致小鼠患骨髓增殖性腫瘤。在人類血液腫瘤中，僅有報道利用生物信息學分析預測XIST可能在急性B細胞型淋巴細胞性白血病的發展中發揮重要作用，可作為潛在的治療靶點[15]，而在AML中的研究未見報道。因此，本研究具有原始創新性。本研究也表明，LncRNA XIST表達水平的不同與AML分型、有無發生髓外浸潤、白細胞數以及乳酸脫氫酶水平等臨床參數具有相關性。進一步分析顯示低表達組的LncRNA XIST的生存率明顯低于高表達組。同時，本研究還采用了COX多因素回歸分析影響AML預后的獨立因素，研究發現白蛋白與球蛋白比值和LncRNA XIST可能是其獨立的預后因素，其他臨床參數包括乳酸脫氫酶水平、AML分型和有無髓外浸潤等無統計學意義，其原因可能是各個臨床參數之間的相關性或者臨床參數與LncRNA XIST表達水平的高低只是間接影響因素導致的，下一步可擴大病例數驗證上述結果，同時在白血病細胞株中深入研究LncRNA XIST在白血病中的作用及可能的機制。