Nemo樣激酶基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌遺傳易感相關(guān)性

周軼凡，陳婷婷，程筱雯

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常見的癌癥之一，大約35%的CRC風(fēng)險(xiǎn)可歸因于遺傳因素[1]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)構(gòu)成了人類基因組90%以上的遺傳變異，SNP可導(dǎo)致細(xì)胞異常分化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，在過去10年中，已發(fā)現(xiàn)超過60個(gè)SNP位點(diǎn)與CRC相關(guān)[2]。Nemo樣激酶(Nemo like kinase，NLK)是一種進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶[3]，有研究[4-5]表明NLK在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，在肝癌和膽囊癌中高表達(dá)，而在肺癌、乳腺癌和卵巢癌中則低表達(dá)[6-8]。目前NLK與腫瘤的相關(guān)研究多集中在編碼基因的細(xì)胞信號(hào)通路的研究，尚未見關(guān)于NLK的SNP位點(diǎn)與CRC關(guān)系的文獻(xiàn)。此前有研究[9]在進(jìn)行了1 000多例樣本和近400個(gè)有絲分裂激酶SNP位點(diǎn)分析后僅篩選出1個(gè)SNP位點(diǎn)與浸潤(rùn)性上皮性卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，即NLK基因的rs2125846。故該實(shí)驗(yàn)擬通過病例-對(duì)照研究分析該SNP位點(diǎn)在人群中的分布特點(diǎn)，探討其與CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，為高危人群的CRC防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究的所有受試者均來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。病例對(duì)照研究中共納入55例CRC病例和50例健康對(duì)照。所有病例均通過組織病理學(xué)診斷并排除術(shù)前進(jìn)行放化療或者合并糖尿病、腎病等自身免疫性疾病的患者。從健康體檢者中隨機(jī)選擇與病例組年齡和性別相匹配的人群作為對(duì)照組。兩組研究對(duì)象的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 將直徑為3 μm厚的組織切片置于防脫載玻片，然后進(jìn)行免疫組化。首先修復(fù)抗原，然后逐滴加入過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將該切片與多克隆抗NLK抗體在室溫下以1 ∶200的稀釋度溫育，后滴加通用型二抗在室溫孵育，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.2標(biāo)本采集及DNA提取 采集病例組及健康對(duì)照的空腹靜脈血。嚴(yán)格按照試劑盒(購(gòu)自上海百傲公司)的說明書，從外周血白細(xì)胞中提取DNA，使用 NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)DNA含量，測(cè)量吸光度(absorbance, A)值A(chǔ)260和A280，比率均在1.8～2.0。

1.2.3SNP基因分型 該實(shí)驗(yàn)使用羅氏(美國(guó)Roche公司)高分辨率溶解曲線 (LightCycler ? 480， high resolution melting master，HRM )試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用機(jī)器為Roche LightCycler96熒光定量PCR儀。PCR在96孔板中以20 μl的體積進(jìn)行，包括40～60 ng DNA，5 mol/L的每種引物，1.6 μl MgCl2，6.2 μl水和10 μl 2×ResoLight Mix。 按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行：95 ℃、10 min； 95 ℃、10 s，45個(gè)循環(huán)；58 ℃、15 s；72 ℃、15 s。 通過在65～98 ℃下以每1 ℃ 20次采集的速率獲得HRM數(shù)據(jù)。

圖1 CRC組織中NLK的表達(dá)情況 ×200

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，使用χ2檢驗(yàn)來比較病例組和對(duì)照組之間的基本情況。使用非條件Logistic回歸模型分析不同遺傳模型與CRC的關(guān)聯(lián)，并計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(adjusted odds ratio，OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)。 AA表示野生純合基因型，AG表示雜合突變基因型，GG表示純合突變基因型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NLK在結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CRC組織中NLK的表達(dá)水平高于相應(yīng)的癌旁組織。見圖1。

2.2 NLK基因SNP位點(diǎn)rs2125846與CRC易感性的關(guān)聯(lián)性rs2125846多態(tài)性型別為AA、AG、GG，在對(duì)照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=1.02，P>0.05)。病例組中AA、AG、GG的發(fā)生頻率分別為41.8%、58.2%和0%；在對(duì)照組中，相應(yīng)的數(shù)據(jù)分別為52.0%、36.0%和12.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.888，P=0.007 1)，即病例組與正常組之間NLK基因SNP位點(diǎn)rs2125846多態(tài)性分布不同。在共顯性模型中，攜帶AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上顯著，攜帶AG基因型的CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的2.01倍。在隱性模型中，與AA基因型相比，攜帶G等位基因(GG+AG)的患者發(fā)生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍(OR=1.51；95%CI：0.697～3.259)。見表1、2。

表1 NLK基因SNP位點(diǎn)rs2125846基因型分布

表2 病例組和對(duì)照組中NLK基因SNP位點(diǎn)rs2125846

2.3 NLK基因SNP位點(diǎn)rs2125846多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的分層分析根據(jù)常見臨床病理特征、患者年齡及CRC主要發(fā)生部位進(jìn)一步對(duì)rs2125846多態(tài)性進(jìn)行分層分析。在病例組中未檢測(cè)到rs2125846多態(tài)性與病理特征、患者年齡及CRC主要發(fā)生部位有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。見表3。

3 討論

據(jù)全球癌癥年報(bào)統(tǒng)計(jì)，2018年發(fā)生超過180萬(wàn)例新發(fā)CRC和CRC導(dǎo)致死亡881 000例，占癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10。總體而言，CRC的發(fā)病率排名第3，但死亡率排名第2。在最近10年中，中國(guó)的CRC死亡率和發(fā)病率均有所增加[10]。由于早期缺乏特異性和敏感性的分子標(biāo)志物，許多臨床患者在初步診斷時(shí)已被發(fā)現(xiàn)處于中晚期階段[11]。SNP是一種常見的遺傳變異，可導(dǎo)致不同的功能性產(chǎn)物而影響個(gè)體對(duì)疾病的易感性。因此，SNP可被視為預(yù)測(cè)包括CRC在內(nèi)的散發(fā)性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。在過去的30年中，較多SNP通過廣泛的全基因組關(guān)聯(lián)研究和候選基因關(guān)聯(lián)研究，確認(rèn)與CRC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)[12]。由于CRC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜，新的CRC相關(guān)遺傳變異區(qū)域有必要進(jìn)一步探索，以期尋求更有效的分子標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)。越來越多數(shù)據(jù)表明NLK被認(rèn)為是潛在的腫瘤抑制因子或致癌基因，NLK的沉默或上調(diào)可以為腫瘤提供有效的治療手段[13]。本研究中，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CRC組織中NLK的表達(dá)水平高于癌旁組織，該結(jié)果與之前的文獻(xiàn)結(jié)果一致，NLK的過度表達(dá)與較差的臨床病理參數(shù)相關(guān)，如晚期TNM分期、分化差、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及較高的CRC復(fù)發(fā)率[14]。NLK基因定位于人類染色體17p12，包含多個(gè)SNPs，其中 rs2125846位于NLK基因的第6個(gè)內(nèi)含子內(nèi)(2364A/G)，在2 364位點(diǎn)發(fā)生A—G的堿基替換。有研究[15]表明一些內(nèi)含子多態(tài)變體具有賦予疾病易感性的潛力，由于內(nèi)含子含有多種功能元件，包括內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子和沉默子，以及調(diào)節(jié)可變剪接的順式作用RNA元件等，因此內(nèi)含子區(qū)域的SNP對(duì)靶基因可能比迄今所認(rèn)為的有更大的影響力。

表3 NLK基因SNP位點(diǎn) rs2125846多態(tài)性與CRC常見臨床病理學(xué)特征及年齡、腫瘤發(fā)生部位的關(guān)聯(lián)分析

本研究NLK基因的SNP位點(diǎn)rs2125846中，病例組中AA、AG、GG的發(fā)生頻率分別為41.8%、58.2%和0%；而在對(duì)照組中則相應(yīng)為52.0%、36.0%和12.0%，病例組與正常組之間NLK-2364A/G基因型分布顯著不同(χ2=9.888，P=0.007 1)。在共顯性模型中，攜帶AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上顯著，攜帶AG基因型的CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的2.01倍。在隱性模型中，與AA基因型相比，攜帶G等位基因(GG+AG)的患者發(fā)生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍。rs2125846多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的分層分析中未檢測(cè)到患者NLK-2364A/G與年齡、CRC主要發(fā)生部位及常見臨床病理特征有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，考慮其可能的原因有兩個(gè)：一是因?yàn)闃颖玖科伲潜敬窝芯可婕暗腃RC相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素及常見臨床病理特征偏少。接下來的實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)大樣本量同時(shí)納入更多的CRC相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素及常見臨床病理特征進(jìn)行更進(jìn)一步的分析，目前SNP rs2125846作用的具體機(jī)制尚不清楚，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)也將進(jìn)行該位點(diǎn)的功能驗(yàn)證。

總之，本研究在中國(guó)人群中鑒定了位于人類NLK基因內(nèi)含子內(nèi)的與CRC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的新易感位點(diǎn)rs2125846。隨后需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，擴(kuò)大種族和地理覆蓋范圍及進(jìn)行功能驗(yàn)證，以確認(rèn)NLK基因?qū)RC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。