表沒食子兒茶素沒食子酸酯對斑塊狀銀屑病患者Th1/Th2免疫平衡的影響

付丹丹 胡華 張孟杰 李敏 李占國 田中偉

新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚性病科，河南衛輝 453100

銀屑病的發病機制復雜，是在多種基因遺傳因素的共同作用下，由輔助性T 淋巴細胞介導［1］。輔助性T 細胞可分為Th1 和Th2 兩個亞群，其介導的免疫功能失衡在銀屑病的發病中發揮關鍵作用［2］。尋常型斑塊狀銀屑病沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從綠茶中提取出的多酚活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗癌等多種作用［3-4］。最新研究發現，EGCG能夠通過調節Th1/Th2細胞功能抑制結腸炎的炎性水平，提示其可能通過影響Th1/Th2 的免疫平衡對炎性疾病起治療作用［5］。本研究以 Th1 和 Th2 細胞為研究對象，探討EGCG對銀屑病Th1/Th2免疫細胞平衡的影響及機制，為EGCG在銀屑病治療中的可能應用提供理論依據。

材料與方法

一、材料

1.研究對象：尋常型斑塊狀銀屑病患者33例，其中男 18 例，女15 例，年齡22～56 歲。銀屑病面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）2.4 ～ 12.3，病程3個月至5年。均來自新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚科，受試者均根據《中國臨床皮膚病學》［6］的診斷標準確診，且1 個月內未經治療。所有患者均無其他系統性疾病和自身免疫性疾病。本研究獲得新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準（2018119），受試者均簽署知情同意書。

2.主要試劑：胎牛血清、青霉素、鏈霉素和RPMI 1640 培養基為美國Gibco 公司產品。EGCG產自江蘇凱吉生物公司（CAS：989-51-5，純度≥98%）。人白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-10 和干擾素 γ（interferonγ，IFNγ）ELISA 試劑盒為美國R&D Systems 公司產品。Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒產自大連TaKaRa公司。Th1 細胞轉錄因子T-bet 和Th2 細胞轉錄因子GATA3和β肌動蛋白引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、實驗方法

1.標本采集：抽取銀屑病患者空腹肘靜脈血10 ml放置于肝素鈉抗凝管中。密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。細胞加入含10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 完全培養基，放置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。

2.MTT檢測細胞活力：PBMC以6× 103個/孔接種于96孔板，每組3個復孔。EGCG 溶解于不含血清的RPMI 1640 培養基中，PBMC 培養至對數生長期時分別加入20、40、60、80、100 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG 的正常培養細胞為對照，培養24 h。棄原培養液后每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37 ℃培養4 h。棄上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min 使結晶充分溶解，使用酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）檢測細胞吸光度（A490 值），計算細胞活力，選取EGCG 作用濃度。

3.EGCG 處理PBMC：隨機選取3 例斑塊狀銀屑病患者的PBMC，加入60 μmol/L 的EGCG，以不加EGCG的正常培養細胞為對照，培養24 h后作后續檢測。

4.流式細胞儀檢測Th1 和Th2 細胞比例：實驗細胞經0.25%胰酶消化，PBS 洗滌、離心，再用100 μl 緩沖液重懸細胞后，加入 FITC-CD4 進行表面染色、固定和破膜，隨后加入PE-IFNγ或PE-IL4，4 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，然后上流式細胞儀檢測Th1和Th2細胞比例。

5.ELISA 法檢測細胞因子：PBMC 經過EGCG處理后，根據ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測細胞培養上清液中Th1 細胞分泌因子（IL-2 和IFNγ）和Th2細胞分泌因子（IL-4和IL-10）表達量。

6.實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：Trizol 法提取細胞總RNA。紫外分光光度計檢測RNA 濃度，100 ng總RNA用逆轉錄得到cDNA。以β肌動蛋白為內參基因，用qRT-PCR 試劑盒檢測T-bet、GATA3 mRNA表達水平。T-bet正向引物序列為5′-CCCATCCCTTCCCTGTAT-3′，反向引物為 5′-GTC CATTCTCCGTTCTCCA-3′；GATA3的正向引物為 5′-TCACAAAATGAACGGACAGAACC-3′，反向引物為 5′-GGTGGTCTGACAGTTCGCAC-3′；β 肌動蛋白正向引物序列為 5′ -CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，反向引物為5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。PCR 反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環，40 ℃ 15 min。2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

7.統計學分析：采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學處理，計量資料采用表示，實驗數據用t檢驗分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、MTT法檢測EGCG對PBMC的毒性

見圖1。EGCG 作用 PBMC 24 h 后，與對照組（不加EGCG）相比，20、40、60 μmol/L EGCG組PBMC活力沒有顯著變化，80 μmol/L 組和100 μmol/L 組顯著下降（t=5.17，P=0.006；t=10.09，P=0.005）。因此選擇60 μmol/L為EGCG作用細胞的最適無毒濃度。

二、EGCG對Th1/Th2比例的影響

見圖2。60 μmol/L EGCG 處理 PBMC 后，Th1的細胞水平低于對照組，兩組差異有統計學意義（t=3.43，P=0.026）；Th2細胞水平高于對照組，兩組差異有統計學意義（t=6.68，P=0.026）。

三、EGCG 對銀屑病患者Th1、Th2細胞因子表達的影響

結果顯示，與對照組相比，EGCG 組IL-2 和IFNγ水平顯著降低（P＜ 0.05），IL-4和IL-10表達水平顯著提高（P＜ 0.05）。見表1。

四、EGCG對銀屑病患者 Th1、Th2轉錄因子表達的影響

60 μmol/L EGCG 處理細胞后，EGCG 組 T-bet mRNA表達量（1.21±0.19）低于對照組（2.56±0.22），兩組差異有統計學意義（t= 11.99，P＜ 0.001）；GATA3 mRNA表達量（3.21 ± 0.24）高于對照組（1.47± 0.11），兩組差異有統計學意義（t=18.62，P＜ 0.001）。

討 論

圖1 不同濃度沒食子兒茶素沒食子酸酯對銀屑病患者外周血單個核細胞活力的影響 1 ～ 6：分別為0（對照組）、20、40、60、80、100 μmol/L EGCG組

圖2 沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對銀屑病患者外周血單個核細胞Th1 和Th2 細胞的影響 2A：流式細胞儀檢測Th1 和Th2細胞數；2B：不同組中Th1和Th2細胞占PBMC的比例

表1 沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）刺激下外周血單個核細胞細胞分析細胞因子變化（，ng/L）

表1 沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）刺激下外周血單個核細胞細胞分析細胞因子變化（，ng/L）

注：a 與對照組比較，P＜0.05

分組對照組EGCG t值P值白細胞介素2 1 568.32±196.45 824.45±101.21a 5.83 0.004干擾素γ 3 287.63±235.54 1 623.62±185.56a 9.61＜0.001白細胞介素4 225.38±26.92 389.48±46.63a 5.28 0.006白細胞介素10 165.46±32.25 285.95±53.28a 3.35 0.029

研究證明，EGCG 具有抗炎活性，對動脈粥樣硬化、神經系統炎癥、食管炎等疾病有治療作用［7］。Th1/Th2免疫比例失衡在銀屑病的發病過程中也起到重要作用［8］。通過調節Th1/Th2比例減緩疾病嚴重程度已成為研究熱點之一［9］。我們的前期研究發現，EGCG 可以抑制IL-17 誘導的角質形成細胞增殖和凋亡異常［10］。為了研究EGCG 對斑塊狀銀屑病免疫的影響，在本研究中，我們利用斑塊狀銀屑病患者PBMC，研究EGCG 對Th1/Th2 細胞的調節作用。

T 細胞的效應功能大部分是通過細胞因子調控的，不同的T細胞亞群通過分泌特異細胞因子發揮不同的生物學功能。Th1 型細胞通過分泌細胞因子IFNγ和IL-2活化毒性T細胞、巨噬細胞，并促進對靶細胞的殺傷和吞噬［11］。研究表明，IFNγ 和IL-2 在銀屑病患者的血清和皮損中表達顯著升高［12］。銀屑病患者Th2細胞通過分泌IL-4和IL-10因子發揮炎癥抑制作用，并且IL-4 和IL-10 在輕重度銀屑病患者血清中均出現異常低表達［13-14］。我們的前期研究發現，在銀屑病患者外周血中IFNγ和 IL-2 高表達，而 IL-4 和 IL-10 低表達［15］。本文結果表明，EGCG 降低銀屑病患者PBMC Th1 細胞因子IL-2和IFNγ分泌量，同時增加Th2細胞因子IL-4和IL-10分泌量，從而發揮免疫調節作用。

為了探討EGCG 對斑塊狀銀屑病可能的治療作用，我們針對性探討了EGCG對斑塊狀銀屑病患者 PBMC 的影響。結果顯示，EGCG 能下調 Th1 細胞水平，上調Th2細胞水平，表明其對Th1/Th2細胞免疫平衡有調節作用。在T 細胞的亞群分化過程中，轉錄因子具有重要的調節作用。轉錄因子T-bet 和 GATA3 分別特異性表達在 Th1 和 Th2 細胞中。研究表明，T-bet 不僅能夠促進Th1 細胞因子IFNγ、IL-12 的產生，而且可以抑制Th2 細胞因子IL-4的產生，即其具有促進Th1型細胞分化作用的同時也能抑制Th2 型細胞分化［16］。轉錄因子GATA3 能夠通過提升 IL-4 并抑制 IFNγ 的表達，促進發育中的Th1 型細胞反轉為Th2 型，特異性的調控 Th2 細胞的分化［17］。本研究結果顯示，EGCG 抑制銀屑病患者PBMC 中T-bet mRNA 表達，并促進GATA3 mRNA 表達，說明 EGCG 對 Th1 和 Th2 型細胞的轉錄因子有調節作用。

綜上所述，我們的實驗結果證實，EGCG 能夠減少銀屑病患者Th1細胞數量，抑制Th1細胞因子和轉錄因子的表達，同時上調Th2 細胞數量及Th2細胞因子和轉錄因子的表達，提示EGCG可能通過調節Th1/Th2 細胞平衡，影響銀屑病的發病進程。在今后的研究中，我們可以繼續探索EGCG對銀屑病患者免疫異常的影響，例如對Th17，Treg 等免疫細胞影響等。另外還會從體內實驗出發，研究在動物模型中EGCG的藥物作用，為其在臨床上的應用提供更多依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突