miR-582-5p通過誘導EMT抑制胃癌細胞的侵襲轉移

劉 棟,王建華△,高增戰*,劉思達,段降龍,劉 斌,武 敏,毛智軍,張 濤,薛 飛,普彥淞,龍延濱

(1陜西省人民醫院普外二科,西安 710068;2陜西省人民醫院內分泌科,西安 710068;△共同第一作者;*通訊作者,E-mail:gaoxi8004@163.com)

胃癌(gastric cancer,GC)的發病率逐年上升,全球的發病率占據惡性腫瘤發病率的第5位,死亡率位居惡性腫瘤第3位[1,2],死亡人數量約占全部惡性腫瘤死亡總人數的9.2%,嚴重危害人類的健康[3]。近年來多學科診療模式(multimodality therapy,MDT)在胃癌診療已經取得了很大的進展,但MDT所診療患者病情常較為復雜,或已失去胃癌的最佳治療時機,大多數進展期胃癌患者預后仍較差,Ⅰ期胃癌患者5年生存率為大于85%,而Ⅳ期胃癌患者的5年生存率小于15%。侵襲和轉移是導致患者胃癌死亡的重要因素之一[4]。有30%-50%的初診胃癌患者同時合并肝轉移,嚴重影響其預后[5]。因此,深入研究胃癌侵襲轉移的發生發展的分子機制,為進展期胃癌的治療策略提供實驗依據,具有重要的現實意義。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是涉及上皮細胞惡性轉化的一系列生物學程序,細胞失去極性并與鄰近細胞接觸,隨后得到間充質樣運動表型。EMT在腫瘤的惡性表型中發揮著關鍵和復雜的作用,包括癌癥干細胞表型,耐藥性,循環腫瘤細胞和腫瘤出芽的產生[6]。microRNA(miRNA)是一類19-25個核苷酸大小的非編碼RNA,調節各類細胞的生長進程,包括生長、發育、分化、代謝和凋亡等等[7]。miR-582-5p是最初鑒定的一類重要的miRNA成員,前期研究已經證實其參與各類腫瘤的發生和發展,但其在不同腫瘤中的作用還存在不一致,如在直腸癌發生發展中miR-582-5p表現出促進腫瘤生長,而在前列腺癌中表現出抑癌基因,所以有必要研究miR-582-5p在胃癌中的作用以及侵襲轉移機制[8-10]。本研究采用miR-582-5p mimics上調胃癌細胞miR-582-5p表達,研究其對胃癌細胞侵襲、遷移能力的影響,對EMT相關分子表達的影響,初步探討對胃癌轉移的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司);反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。miR-582-5p、U6引物、miR-582-5p mimics及Negative control(上海吉瑪生物科技有限公司);RPMI-1640、Transwell小室培養基(美國Corning公司);胎牛血清、OPTI-MEN(法國Gibco公司);Matrigel膠(美國BD公司)。real-time PCR試劑(日本TaKaRa公司);real-time PCR儀(日本Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養

人胃癌細胞株SGC-7901、AGS和胃正常上皮細胞GES-1由陜西省人民醫院實驗室長期保存。RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清),置于37 ℃、5% CO2培養箱中,采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代,取生長狀態良好的對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 real-time PCR檢測胃癌細胞株miR-582-5p的表達量

Trizol試劑提取細胞總RNA,嚴格按照操作說明書進行實驗,每樣取2 μg RNA反轉錄成cDNA進行reai-time PCR檢測,引物序列:miR-582-5P正向5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′;反向:5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′。U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95 ℃預變性30 s；隨后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個樣本的U6作為內參，基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算分析。

1.4 Western blot檢測上調miR-582-5p對胃癌細胞EMT標志性基因表達的影響

取生長至對數期的SGC-7901和AGS細胞,6孔板中每孔加入2×105個細胞,當細胞生長、融合至80%左右時,收集細胞,RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA蛋白濃度定量試劑盒按照操作說明進行蛋白定量,按照30 μg蛋白上樣量進行12% SDS-PAGE分離蛋白,采用半干式轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉2 h,順序經一抗(1 ∶100稀釋的鼠抗人Slug、Snail、vimentin、fibronectin、E-cadherin抗體)和二抗(1 ∶1 000)孵育,ECL顯色、凝膠成像分析系統采集圖像,GAPDH作為內參,灰度分析。

1.5 細胞轉染

將對數生長期SGC-7901和AGS細胞按照2×105個接種于6孔板,按照實驗設計分為實驗組(轉染miR-582-5p mimics)、空白對照組(轉染negative control)。用250 μl OPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉染試劑5 μl,室溫下靜置5 min,再用250 μl OPTI-MEN稀釋實驗組和空白對照組5 μl,兩者混合室溫靜置20 min,每孔加入500 μl中的轉染復合液,于5% CO2、37 ℃孵育6 h,用新鮮的完全培養基(含血清)替換含有轉染復合物的培養基,供后續實驗使用。

1.6 劃痕試驗檢測上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞侵襲轉移的影響

將對數生長期SGC-7901和AGS細胞按照5×105個接種于6 cm培養皿,待細胞長滿后,用200 μl移液器槍頭劃痕,PBS沖洗3次,更換為無血清培養基,繼續培養,取48 h曝光顯影,測量遷移距離、計算相對遷移率,劃痕遷移率=(劃痕后即刻劃痕面積-劃痕后24 h劃痕面積)/劃痕后即刻劃痕面積×100%。

1.7 侵襲實驗檢測上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞侵襲轉移的影響

Matrigel膠在4 ℃過夜并融化，和1640培養基按照1 ∶8比例稀釋，每孔50 μl包被Transwell小室底膜的上室面，室溫風干。接種轉染48 h的AGS和SGC-7901細胞，調整細胞密度至1×105個/ml，取200 μl接種于上層小室，小室加入600 μl含10%胎牛血清的1640培養基。在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育48 h。取出Transwell小室吸除培養基,利用棉簽拭去Transwell小室濾膜上面的Matrigel和未穿過濾膜的AGS和SGC-7901細胞，95%酒精固定5 min，結晶紫溶液染色1 h。顯微鏡觀察并計數,取平均值。

1.8 統計學分析

采用SPSS21.0統計學分析軟件,兩組間差異分別采用兩樣本t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-582-5p在胃癌細胞中的表達

實驗采用real-time PCR檢測人胃癌細胞株SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-28和正常胃上皮細胞GES-1細胞株miR-582-5p的表達量,結果顯示,相比正常胃上皮細胞GES-1,miR-582-5p的表達在胃癌細胞SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、MKN-28中表達顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.05,見圖1)。為了研究miR-582-5p在胃癌侵襲轉移中的作用,選取miR-582-5p相對表達較高的SGC-7901和AGS細胞用作后續實驗研究細胞株,采用轉染miR-582-5p mimics法上調miR-582-5p的表達。

與EGS比較,*P<0.05圖1 MiR-582-5p在5種胃癌細胞中的表達Figure 1 Expression of miR-582-5p in five gastric cancer cells

2.2 miR-582-5p過表達鑒定

miR-582-5p mimics轉染前實驗選中的SGC-7901和AGS細胞,real-time PCR鑒定過表達效率。SGC-7901和AGS細胞在轉染miR-582-5p mimics后實驗組miR-582-5p表達水平顯著低于空白對照組(negative control),差異有統計學意義(均P<0.05,見圖2)。

2.3 上調miR-582-5p對胃癌細胞侵襲的影響

研究miR-582-5p在胃癌侵襲、轉移的作用,采用Tranaswell實驗和細胞劃痕實驗研究上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞侵襲轉移的影響。細胞劃痕實驗結果顯示,與陰性對照組比較,轉染組的SGC-7901和AGS細胞的遷移能力明顯減弱,差異有統計學差異(均P<0.05,見圖3)。Tranaswell實驗結果顯示,相比陰性對照組,轉染了miR-582-5p mimics的SGC-7901和AGS細胞的侵襲能力明顯降低,差異有統計學差異(P<0.05，見圖4)。

與negative control比較,*P<0.05圖2 胃癌細胞株SGC-7901和AGS轉染miR-582-5p mimics后miR-582-5p的表達Figure 2 Expression of miR-582-5p in SGC-7901 and AGS cells after transfection with miR-582-5p mimics

與negative control比較,*P<0.05圖3 細胞劃痕實驗檢測上調miR-582-5p對SGC-7901細胞和AGS細胞遷移能力的影響Figure 3 The effect of up-regulation of miR-582-5p on the migratory ability by would healing assay

2.4 上調miR-582-5p對胃癌細胞EMT標志性基因表達的影響

為了研究miR-582-5p對胃癌細胞EMT的作用,本研究采用了real-time PCR和Western blotting檢測了上調miR-582-5p對胃癌細胞EMT標志性基因表達的影響。結果顯示,相比對照組(negative control),轉染了miR-582-5p mimics的SGC-7901和AGS細胞中Slug、Snail、vimentin及fibronectin表達降低,E-cadherin表達升高,差異具有統計學差異(均P<0.05,見圖5,6)。結果提示上調miR-582-5p增加胃癌細胞EMT的作用。

與negative control比較,*P<0.05圖4 Transwell實驗研究上調miR-582-5p后胃癌SGC-7901和AGS細胞的侵襲能力 (結晶紫染色×100)Figure 4 The effect of up-regulation of miR-582-5p on the migratory ability by Transwell assay (crystal violet staining,×100)

與negative control比較,*P<0.05圖5 real-time PCR檢測上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞EMT指標的影響Figure 5 Effect of up-regulation of miR-582-5p on levels of EMT-related genes detected by real-time PCR

2.5 阻斷Wnt/β-catenin信號通路減弱miR-582-5p對胃癌細胞侵襲轉移的抑制作用

本研究采用Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路后,觀察上調miR-582-5p后對細胞侵襲遷移的影響。結果顯示,Dickkopf-1減弱了上調miR-582-5p對胃癌細胞侵襲的抑制作用(均P<0.05,見圖7)。提示Wnt/β-catenin信號通路可能參與到miR-582-5p對結胃癌侵襲、轉移的調控。

3 討論

轉移是導致胃癌死亡率增高的原因之一。肝臟是胃癌轉移最常見的靶器官。未治療的胃癌肝轉移患者中位生存時間僅有6個月,失去切除機會的患者5年生存率低于5%。所以深入研究與胃癌侵襲、轉移有關的基因及其致癌、侵襲信號傳導通路非常有必要。miRNA是真核生物中廣泛存在的一類重要的調控分子,是參與惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉移及耐藥等過程的關鍵基因?，F階段在膀胱癌的研究中,過表達miR-582-5p的膀胱癌增殖及侵襲減慢[10]。作用機制可能是miR-582-5p抑制TGF-β信號通路影響前列腺癌的侵襲和骨轉移。然而,miR-582-5p對胃癌中侵襲、轉移的機制和相關通路未見文獻報道。本研究上調miR-582-5p表達明顯抑制胃癌細胞侵襲、遷移能力,提示miR-582-5p可能參與胃癌的遠處轉移。

A.SGC-7901細胞中EMT相關蛋白的相對表達量 B.AGS細胞中EMT指標蛋白表達量與negative control比較,*P<0.05圖6 Western blotting檢測上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞EMT相關蛋白的影響Figure 6 Effect of up-regulation of miR-582-5p on levels of EMT-related proteins by Western blotting

圖7 Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路后觀察上調miR-582-5p對SGC-7901和AGS細胞侵襲的影響Figure 7 Effect of blockage of the Wnt/β-catenin pathway by Dickkopf-1 on invasive abilities of SGC-7901 and AGS cells enhanced by up-regulation of miR-582-5p

上皮-間質轉化(EMT)是多種生化變化中的必需過程,包括胚胎發育,組織重塑和傷口愈合[11]。近年來的研究表明EMT在腫瘤侵襲轉移中起著關鍵性的作用。許多轉移性腫瘤的侵襲前,常常伴有EMT轉換[12]。已經有研究表明Slug、Snail、ZEB1和Twist等轉錄因子參與了EMT的調控[13]。其中,Snail基因是EMT主要的控制者,能夠明顯抑制E-cadherin的表達。而上皮性指標E-cadherin失去作用被公認為是EMT的標志[14]。本研究上調miR-582-5p抑制胃癌細胞Slug、Snail、fibronectin及vimentin表達升高和E-cadherin表達降低,提示上調miR-582-5p抑制胃癌細胞EMT的作用。

近年來,已證明幾種關鍵信號通路參與腫瘤的EMT進程,包括Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β/Smad、PI3K/Akt和Notch通路[15-17]。Wnt/β-catenin信號通路是維持胃腸道穩定和增殖的主要信號傳導途徑之一[18]。Wnt信號傳導的異常激活參與胃癌的發生發展。Wnt信號通路路徑中組分的突變及下游的β-catenin的激活,是癌癥發生的重要的標志性分子事件[19,20]。在非小細胞肺癌中,過表達miR-582-5p通過激活Wnt/β-catenin信號通路維持干細胞特性,抑制克隆形成能力和侵襲[7]。因此,本研究探討了Wnt/β-catenin是否參與miR-582-5p對胃癌侵襲轉移及EMT的調控,Dickkopf-1阻斷Wnt/β-catenin信號通路促進miR-582-3p對胃癌細胞侵襲轉移的抑制作用,提示上調miR-582-5p可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌侵襲轉移及EMT。已有學者證明在非小細胞肺癌中,miR-582-5p通過靶向抑制Axin2、DKK3和SFRP1表達,促進Wnt/b-catenin通路激活。然而,在胃癌中,miR-582-5p激活Wnt/β-catenin信號通路的具體分子機制仍有待于進一步的研究。

遠處轉移是導致胃癌患者預后差的主要因素。盡管近年來,腫瘤的生物治療取得了較大的進展,但也面臨著諸多問題,如缺乏合適的預測腫瘤轉移的指標。本研究上調miR-582-5p抑制胃癌侵襲轉移及EMT,并且得出Wnt/β-catenin信號通路可能參與其中。因此上調miR-582-5p的表達,可以減緩胃癌的轉移,可能為胃癌的生物治療提供新的治療策略。