基于基因表達數據庫篩選膀胱癌中差異表達的環狀RNA

吳文婧,趙車冬,龐 歡,趙 華,申 濤,陳 葳

(西安交通大學第一附屬醫院檢驗科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:chenweixjtu2014@126.com)

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤,全球范圍內每年新增的膀胱癌患者超過33萬例,死亡病例多于3萬例[1]。在我國,膀胱癌發病率在泌尿系統中居于首位,且呈逐年上升趨勢,嚴重威脅人類的健康和生命[2,3]。膀胱癌生物學行為復雜,且治療后易復發,容易發生侵襲和轉移,其發病機制涉及大量基因表達、功能異常及多種信號通路的改變。環狀RNA(circular RNA, circRNA)是具有閉合環狀結構的一類新型RNA[4]。近年來,circRNA被發現與包括腫瘤在內的多種疾病相關,通過多種機制參與疾病的發生發展[5-7]。但是與膀胱癌相關的circRNA目前研究尚不多見[8]。

本研究基于基因表達數據庫(GEO),利用生物信息學方法對膀胱癌相關circRNA進行篩選,并對其相關通路進行預測。本研究結果對于深入研究膀胱癌的分子機制,尋找新的診斷標志物和有效治療靶點,提供了一定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

從GEO數據庫中篩選含有膀胱癌和癌旁組織基因表達信息的數據集,發現膀胱癌circRNA表達譜數據集GSE92675,該數據集來自Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1芯片數據共8張,分別為4例膀胱癌組織和4例配對的癌旁組織,該芯片可檢測5 397條circRNA。

1.2 方法

1.2.1 數據來源 從NCBI的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載膀胱癌circRNA表達譜數據集GSE92675的數據,使用R軟件包對GEO92675芯片數據進行分析,通過差異表達倍數和P值進行篩選,采用t檢驗,篩選兩組樣本間差異表達的circRNA。

1.2.2 生物信息學分析 通過生物信息學網站(http://www.circbase.org;http://starbase.sysu.edu.cn/)預測與上調或者下調表達的circRNA相互作用的靶microRNA。應用Cytoscape軟件構建circRNA-miRNA網絡。使用FunRich軟件對microRNA的靶基因進行預測并進行基因本體論(gene ontology,GO)生物學通路富集分析。

2 結果

2.1 膀胱癌中差異表達circRNA的篩選

將腫瘤組和正常組芯片分析數據進行比較,從芯片數據中篩選出3 423個差異表達的circRNA,首先對校正的P值進行篩選,篩選條件為P校正<0.01,經過篩選,得到670個circRNA。再通過篩選差異表達倍數(fold change,FC),選擇|logFC|>1.5的circRNA,得到153個circRNA,其中表達上調的有114個circRNA,表達下調的circRNA有39個(見圖1)。膀胱癌中上調10倍以上的circRNA,及表達下調10倍以上的circRNA見表1、2。

2.2 差異表達circRNA在芯片所用組織中的表達譜

選取表達上調和下調差異倍數前5位的circRNA,從GEO數據庫中調取其表達量,如圖2所示,has-circ-0000144、0000658、0023642、0002623、0032821在膀胱癌組織中高表達,而has-circ-0003266、0092342、0007158、0028173、0009361在膀胱癌組織中的表達低于癌旁正常組織。

藍色點代表符合篩選條件的circRNA P校正<0.01,|logFC|>1.5,紅色點代表不符合篩選條件的circRNA圖1 膀胱癌差異表達circRNA火山圖Figure 1 Volcano plots of differentially expressed circRNAs of bladder cancer

表1 膀胱癌中表達上調10倍以上的circRNA

Table 1 Upregulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相關基因倍數Phsa-circ-0000144SLAMF653.640.000000924hsa-circ-0000658MCTP249.990.00000013hsa-circ-0023642UVRAG40.500.000000112hsa-circ-0002623VANGL139.360.000000916hsa-circ-0032821CEP12833.740.00000328hsa-circ-0008035EXT131.760.000000924hsa-circ-0005273PTK230.890.000073hsa-circ-0084171FNTA30.790.00000186hsa-circ-0058058ATIC29.300.000000924hsa-circ-0061265None26.570.00000226hsa-circ-0001336EEFSEC21.870.00146hsa-circ-0041103TCF2521.360.00000264hsa-circ-0047322TAF4B20.200.00000013hsa-circ-0072088ZFR15.520.0000756hsa-circ-0008558LONP214.380.00000013hsa-circ-0041151RPH3AL12.630.00000013hsa-circ-0011385EIF3I12.080.00000583hsa-circ-0060219SOGA111.110.0000053hsa-circ-0000520RPPH110.480.000225hsa-circ-0003528SEC24A10.450.00067

表2 膀胱癌中表達下調10倍以上的circRNA

Table 2 Down-regulated circRNAs with over 10 fold change in bladder cancer

circRNA相關基因倍數Phsa-circ-0003266LRIG117.330.0000876hsa-circ-0092342RPL27A14.230.000265hsa-circ-0007158FAM169A10.470.0000613hsa-circ-0028173ATP2A210.370.0000136

圖2 差異表達circRNA在芯片所用組織中的表達Figure 2 Expression of circRNAs with differentially expression in the tissues of chip

2.3 circRNA-SOGA1的生物信息學分析結果

對上調或下調的circRNA進行相關文獻檢索分析,發現上調倍數為11倍的circRNA-SOGA1的相關基因SOGA1(suppressor of glucose 1)可能參與腫瘤的發生發展,因此對circRNA-SOGA1作進一步分析。通過生物信息學網站starbase預測與circRNA相互作用的靶microRNA,結果提示與circRNA-SOGA1相互作用的miRNA有103個,利用Cytoscape構建其circRNA-miRNA相互作用網絡(見圖3A)。FunRich軟件對該103個miRNA的靶基因進行預測,并進行GO分析,分析結果發現,這些miRNA的靶基因主要參與蛋白多糖介導的信號通路、ErbB受體信號通路、VEGF和VEGFR信號通路等(圖3B)。

3 討論

近年來,隨著膀胱癌發病率的逐年增長,如何阻止膀胱癌的發生發展是其治療的關鍵問題,積極探究膀胱癌發生發展的具體分子機制并尋找新的治療靶點具有十分重要的意義。

研究表明,circRNA可以作為miRNA的分子海綿,通過吸附miRNA,促進miRNA的靶基因的表達[9]。在本研究中,我們通過分析GEO數據庫中膀胱癌相關的circRNA數據集,對膀胱癌相關circRNA進行篩選,結果發現表達上調的有114個circRNA,表達下調的circRNA有39個。提示circRNA可能參與了膀胱癌的進展。有研究發現circRNA在膀胱癌的發生發展中發揮著重要作用[10,11],可以通過circRNA-miRNA-mRNA軸促進或抑制膀胱癌細胞的生長和進展。本研究中利用生物信息學方法發現的在膀胱癌組織上調或下調的circRNA是否在膀胱癌中發揮作用仍需進一步實驗驗證。

圖3 circ-SOGA1調控網絡分析Figure 3 Analysis of circ-SOGA1 regulatory network

本研究中,我們對上調倍數為11倍的circ-SOGA1作進一步的深入分析。circ-SOGA1定位于20號染色體,其相關基因為SOGA1,目前對SOGA1的研究尚不多見。有研究發現,SOGA1在腫瘤干細胞中可以增加線粒體的生物合成,從而增加線粒體質量[12]。SOGA1還表達于人乳頭瘤病毒197型E6和E7相關細胞蛋白[13]。Kruse等[14]在研究微管相關蛋白CLASP2蛋白的相互作用網絡時,發現SOGA1與CLASP2和tubulin共定位,證實SOGA1可能作為一種新的微管相關蛋白發揮細胞骨架的代謝功能。Habieb等[15]的研究探討血循環中的RNA在肝細胞癌中的診斷作用,結果發現血清SOGA1 mRNA在肝癌患者中表達升高,是肝細胞癌的一個獨立預后因素。但是SOGA1在膀胱癌中的功能尚需進一步研究。circ-SOGA1是來源于SOGA1的環狀RNA,在膀胱癌中是否發揮作用還需要進一步實驗證實。而我們進一步對circRNA-SOGA1預測其相互作用的miRNA和靶基因,構建circRNA-miRNA互作網絡,并對相關靶基因進行GO分析,結果顯示這些靶基因在膀胱癌細胞中可能參與蛋白多糖、ErbB受體、VEGF和VEGFR信號通路等多條信號通路。因此推測circRNA-SOGA1可能通過影響靶miRNA的活性或競爭結合靶miRNA來調節miRNA與靶mRNA的作用,進而通過多種信號通路和生物進程來影響膀胱癌的發生發展。但是生物學信息分析結果仍需經過實驗驗證,后續研究中我們將對circ-SOGA1在膀胱癌細胞中進行功能學驗證,并闡明其參與的信號通路。

綜上所述,本研究構建了膀胱癌相關circRNA的互作網絡,為揭示膀胱癌發生發展的分子機制提供一定的理論基礎。對circRNA功能及作用機制的研究,有助于探尋新的膀胱癌候選診斷、治療靶點,并揭示膀胱癌進展過程中的生物學機制。