沉默stathmin逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥鼻咽癌細(xì)胞耐藥性的作用機(jī)制

汪文利，許慧，蔣樹林

1開封市人民醫(yī)院耳鼻喉科，河南 開封475002

2解放軍73101部隊(duì)內(nèi)科，江蘇 徐州221008

微管在細(xì)胞中具有支架、物質(zhì)運(yùn)輸及識別腫瘤 等生物學(xué)功能[1]。微管解聚蛋白stathmin為微管不穩(wěn)定調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一，具有促進(jìn)微管解聚的作用，主要分布在細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。stathmin通過調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，參與細(xì)胞的周期調(diào)控、分化、運(yùn)動及凋亡等過程[2]。stathmin與細(xì)胞內(nèi)的絲裂原激活蛋白激酶3（mitogen-activation protein kinase 3，MAPK3）、周期蛋白依賴性激酶1（cyclindependent kinase 1，CDK1）、Aurora激酶 B（Aurora kinase B，AURKB）相互作用，參與多種信號通路[3]。stathmin 在肺癌[4]、結(jié)直腸癌[5]、前列腺癌[6]、腦膠質(zhì)瘤[7]、黑色素瘤[8]、肝癌[9]、骨肉瘤[10]、膽管癌[11]中均異常表達(dá)。Lin等[12]在鼻咽癌的研究中報(bào)道，潛伏膜蛋白 1（latent membrane protein 1，LMP1）可以通過CDC2介導(dǎo)調(diào)節(jié)Oncoprotein 18（Op18）/stathmin信號通路發(fā)揮致癌作用。Wu等[13]研究報(bào)道，沉默stathmin可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且沉默stathmin聯(lián)合紫杉醇可以增強(qiáng)微管對紫杉醇的敏感性。相關(guān)研究表明，在卵巢癌中沉默stathmin可以顯著抑制順鉑（cisplatin，DDP）耐藥卵巢癌細(xì)胞C13K的增殖，增強(qiáng)卵巢癌對DDP的敏感性[14]。但stathmin在DDP耐藥鼻咽癌中的研究尚未見報(bào)道。Sonic Hedgehog（SHH）信號通路由信號蛋白SHH配體、跨膜蛋白受體PTCH（PTCH1、PTCH2）、跨膜蛋白SMO及下游轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白（GLI1、GLI2、GLI3）組成[15]。當(dāng)缺乏 SHH配體信號的刺激時(shí)，該信號通路處于失活狀態(tài)，當(dāng)SHH配體存在時(shí)，則可激活轉(zhuǎn)錄因子GLI，將SHH信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞的生長[16]。SHH信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中也具有重要作用，如胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等[17-18]。姚莉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SHH可以促進(jìn)鼻咽癌間質(zhì)血管生成，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。但SHH信號通路在鼻咽癌DDP耐藥性中的作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究將建立DDP耐藥鼻咽癌細(xì)胞CNE2/DDP，觀察沉默stathmin對CNE2/DDP細(xì)胞耐藥性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

人鼻咽癌細(xì)胞CNE2購自美國模式菌種收集中心；DDP購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基、人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、胎牛血清、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tertrazolium bromide，MTT）均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、人降鈣素（human calcitonin，HCT）抗體、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（electronics components laboratory，ECL）發(fā)光液和RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；si-stathmin、si-NC由上海吉瑪公司合成；凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）系統(tǒng)購自美國ABI公司；紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司；PCR儀購自美國BIORAD公司。

1.2 DDP耐藥細(xì)胞CNE 2/DDP的建立

采用DDP誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE2，建立DDP耐藥細(xì)胞CNE2/DDP。取對數(shù)生長期的CNE2細(xì)胞在含0.02 μg/ml DDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞能穩(wěn)定生長并傳代時(shí)，逐漸按0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000 μg/ml增加培養(yǎng)基中DDP的濃度，當(dāng)細(xì)胞可以在1.0000 μg/ml DDP培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并傳代超過10次后，標(biāo)記為CNE2/DDP細(xì)胞。將CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選取對數(shù)生長期CNE2/DDP細(xì)胞，將si-stathmin、si-NC按照LipofectamineTM2000說明書要求轉(zhuǎn)染至CNE2/DDP細(xì)胞，并分別標(biāo)記為si-stathmin組、si-NC組，轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制情況

采用濃度為 0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000 μg/ml的 DDP分別處理對數(shù)生長期CNE2細(xì)胞、CNE2/DDP細(xì)胞及si-stathmin組、si-NC組CNE2/DDP細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后吸去上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振蕩待結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度（absorbance，A）值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率（%）=1-OD樣品/OD對照×100%。半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%時(shí)的DDP濃度。耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=（CNE2/DDP細(xì)胞IC50）（/CNE2細(xì)胞IC50）。

1.5 Westernblot法檢測stathmin及相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取適量對數(shù)生長期的CNE2、CNE2/DDP細(xì)胞及si-stathmin組、si-NC組CNE2/DDP細(xì)胞，RIPA裂解后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法對蛋白濃度定量后變性，然后按照蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）操作步驟進(jìn)行蛋白電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-顯影曝光。以目的條帶灰度值與內(nèi)參GADPH灰度值的比值表示目的蛋白stathmin、cleaved caspase 3、Bcl-2、SHH、PTCH1、GLI-1的相對表達(dá)量。

1.6 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

取適量對數(shù)生長期的si-stathmin組、si-NC組CNE2/DDP細(xì)胞，采用 0、0.1250、0.2500 μg/ml的DDP處理24 h后，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次。采用結(jié)合緩沖液500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細(xì)胞儀分析測定細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DDP處理后CNE 2、CNE 2/DDP細(xì)胞增殖抑制率的比較

MTT法檢測結(jié)果顯示：CNE2細(xì)胞和CNE2/DDP細(xì)胞的增殖抑制率均呈DDP濃度依賴性；隨著DDP濃度的增加（0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000 μg/ml），CNE2細(xì)胞和CNE2/DDP細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增加（F=158.7、207.1，P＜0.01）；同一濃度 DDP（0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000 μg/ml）處理后，CNE2/DDP細(xì)胞的增殖抑制率均明顯低于CNE2細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。DDP對CNE2細(xì)胞的IC50為（0.243±0.012）μg/ml，對CNE2/DDP細(xì)胞的IC50為（1.347±0.070）μg/ml，耐藥指數(shù)（RI）為5.591。

表1 不同濃度DDP處理后CNE 2細(xì)胞和CNE 2/DDP細(xì)胞增殖抑制率的比較

2.2 沉默stathmin對CNE 2/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示：隨著DDP濃度的增加（0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000μg/ml），si-NC組和si-stathmin組CNE2/DPP細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸增加（F=248.7、263.8，P＜0.01）。同一 濃 度DDP（0.1250、0.2500、0.5000、1.0000、2.0000 μg/ml）處理后，si-stathmin組CNE2/DPP細(xì)胞的增殖抑制率均明顯高于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。DDP對si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞的IC50為（0.582±0.025）μg/ml，對si-NC組CNE2/DDP細(xì)胞的IC50為（1.320±0.058）μg/ml。

表2 不同濃度DDP處理后si-NC組和si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞增殖抑制率的比較

2.3 CNE 2、CNE 2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示：CNE2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白的相對表達(dá)量為（1.23±0.08），明顯高于CNE2細(xì)胞的（0.78±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.324，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot檢測stathmin蛋白在CNE 2、CNE 2/DDP細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.4 沉默stathmin對CNE 2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白表達(dá)的影響

si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白的相對表達(dá)量為（0.23±0.03），明顯低于si-NC組的（0.92±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.193，P＜0.01）。（圖 2）

圖2 Western blot檢測si-NC組和si-stathmin組CNE 2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白的表達(dá)情況

2.5 沉默stathmin對CNE 2/DDP細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度 DDP（0、0.1250、0.2500 μg/ml）處理CNE2/DDP細(xì)胞后，結(jié)果顯示：隨DDP濃度的增加，si-NC組和si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞的凋亡率均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.65、91.34，P＜0.01）；同一濃度 DDP（0、0.1250、0.2500 μg/ml）處理后，si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞的凋亡率均明顯高于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖3、表3）

2.6 沉默stathmin對CNE 2/DDP細(xì)胞凋亡蛋白及SHH信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 流式細(xì)胞儀檢測si-NC組和si-stathmin組CNE 2/DDP細(xì)胞的凋亡情況

表3 si-NC組和si-stathmin組CNE 2/DDP細(xì)胞凋亡率的比較

si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞中cleaved caspase 3蛋白的相對表達(dá)量明顯高于si-NC組，Bcl-2、SHH、PTCH1、GLI-1蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖4、表4）

圖4 Western blot檢測si-NC組和si-stathmin組CNE 2/DDP細(xì)胞中凋亡蛋白、SHH信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 si-NC組和si-stathmin組CNE 2/DDP細(xì)胞中凋亡蛋白、SHH信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

3 討論

stathmin是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一種磷酸化蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為1.6×104。stathmin家族成員包括stathmin1、SCG10、SCLIP、RB3。stathmin的磷酸化和去磷酸化均可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂紡錘體微管的解聚和組裝，調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的生物學(xué)過程[20]。stathmin的異常表達(dá)會導(dǎo)致微管穩(wěn)態(tài)失衡，紡錘體組裝異常，干擾細(xì)胞周期[21]。stathmin高表達(dá)與腫瘤的生長、分化及腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲有關(guān)。相關(guān)研究表明，stathmin在人類多種惡性腫瘤中過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而stathmin表達(dá)下調(diào)則可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，于是抗stathmin的分子治療成為人類惡性腫瘤研究的新方向[22]。范才文等[23]運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默stathmin可以抑制鼻咽癌細(xì)胞5-8F增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且該研究還運(yùn)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了沉默stathmin對腫瘤生長的抑制作用，揭示了沉默stathmin可以抑制鼻咽癌細(xì)胞5-8F的惡性生物學(xué)表型，表明stathmin對鼻咽癌的惡性進(jìn)展具有促進(jìn)作用，其對惡性腫瘤的治療抗性具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。林雪遲等[24]報(bào)道，Op18/stathmin參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，靶向Op18/stathmin可能成為耐藥性腫瘤治療的新方法。蒲驍麟等[25]在非小細(xì)胞肺癌的研究中揭示，長春堿治療無效患者腫瘤組織內(nèi)stathmin的表達(dá)水平較長春堿治療有效患者明顯升高，表明stathmin基因的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者對長春堿的敏感性呈負(fù)相關(guān)。石英等[14]在研究卵巢癌耐藥中運(yùn)用Western blot法測定DDP敏感細(xì)胞OV2008和DDP耐藥細(xì)胞C13K中stathmin的表達(dá)，運(yùn)用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測沉默stathmin對耐藥細(xì)胞C13K增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示stathmin在DDP耐藥細(xì)胞C13K中高表達(dá)，且沉默stathmin可抑制DDP耐藥細(xì)胞C13K的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)了耐藥卵巢癌細(xì)胞對DDP的敏感性。本研究檢測了鼻咽癌DDP耐藥細(xì)胞CNE2/DDP和鼻咽癌細(xì)胞CNE2中stathmin的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE2/DDP細(xì)胞中stathmin蛋白的相對表達(dá)量明顯高于CNE2細(xì)胞（P＜0.01）；為進(jìn)一步研究stathmin對CNE2/DDP細(xì)胞耐藥性的作用，本研究通過MTT法檢測沉默stathmin后CNE2/DDP細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默stathmin可逆轉(zhuǎn)CNE2/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性，增強(qiáng)DDP對CNE2/DDP細(xì)胞的增殖抑制率。

SHH信號通路在多種腫瘤中均處于活化狀態(tài)，可能與腫瘤的惡性行為密切相關(guān)。但該通路與腫瘤耐藥性的研究很少。劉瑞娟等[26]在研究卵巢癌耐藥中證實(shí)，SHH和GLI-1在紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/PTX中均呈高表達(dá)，化療藥物可通過上調(diào)SHH信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌的耐藥。Song等[27]在卵巢癌耐藥研究中闡明，在DDP耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/DDP中，SHH信號通路蛋白SMO、PTCH和GLI-1的表達(dá)較A2780細(xì)胞明顯升高。本研究采用Western blot檢測了沉默stathmin后CNE2/DDP細(xì)胞中SHH信號通路相關(guān)蛋白SHH、PTCH1、GLI-1和凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bcl-2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，si-stathmin組CNE2/DDP細(xì)胞中cleaved caspase 3蛋白的相對表達(dá)量明顯高于si-NC組，Bcl-2、SHH、PTCH1、GLI-1蛋白的相對表達(dá)量均明顯低于si-NC組（P＜0.01）。表明沉默stathmin可以阻斷SHH信號通路，促進(jìn)DDP耐藥CNE2/DDP細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)CNE2/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。

綜上所述，沉默stathmin可以逆轉(zhuǎn)DDP耐藥的鼻咽癌細(xì)胞CNE2/DDP的耐藥性，其機(jī)制可能與失活SHH信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，為耐藥鼻咽癌的治療提供了新方向。