WISP2在非小細胞肺癌中的表達情況及對肺癌A549細胞周期分布和凋亡情況的影響

董兵，劉曉隗，王蘇，陳秀軍

解放軍第三〇五醫院心胸外科，北京100017

近年來，肺癌的發病率逐步升高，嚴重威脅人類的身體健康，是臨床常見的惡性腫瘤[1]。相關研究顯示，吸煙、職業、環境、電流輻射、遺傳等因素均可引起非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，早期臨床癥狀包括胸部脹痛、痰血等，晚期可出現疲乏、體重減輕、食欲下降和呼吸困難等[3]。研究發現，腫瘤組織中異常表達的WNT1誘導信號通路蛋白2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）可能與腫瘤的發生、發展密切相關[4]，但WISP2蛋白的具體作用機制尚未明確且其與生物學特征關系的報道較少。相關數據顯示，WISP2基因具有多功能調節的作用，是腫瘤細胞增殖的負性調節因子，WISP2的缺失可能是導致腫瘤細胞增長失控的原因[5-7]，因此，WISP2成為近年來臨床的主要研究熱點[6]。本研究主要探討WISP2在NSCLC中的表達情況及對肺癌A549細胞生物學行為的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2019年3月解放軍第三〇五醫院收治的NSCLC患者。納入標準：①均經病理學確診為NSCLC；②生存時間＞3個月；③臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期；④臨床資料完整。排除標準：術前未接受放化療及其他抗腫瘤治療；合并其他系統繼發性惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入60例NSCLC患者，其中男37例，女23例；年齡44～75歲，平均年齡為（55.38±6.77）歲，＜60歲21例，≥60歲39例；病理類型：鱗狀細胞癌35例，腺癌21例，其他4例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ期36例；分化程度：低分化31例，中分化26例，高分化3例；吸煙35例，不吸煙25例；淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移22例。同時取60例NSCLC患者的NSCLC組織和相應的癌旁正常組織。

1.2 免疫組化法檢測WISP 2蛋白的陽性表達情況

取NSCLC組織和相應的癌旁正常組織制成4 μm的切片，脫蠟、水化、修復等。采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法檢測WISP2蛋白的陽性表達情況，具體步驟按照說明書進行。抗原修復后，滴加山羊非免疫血清工作液封閉，加入一抗，3℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后，加入二抗，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染。SP免疫組化法檢測NSCLC組織和癌旁正常組織中WISP2的表達情況。在光鏡下觀察WISP2蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性表達的石蠟切片作為陽性對照。

1.3 細胞實驗方法

1.3.1 細胞、主要試劑及儀器順鉑耐藥的肺癌A549細胞株購自美國BD公司。膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購自美國Sigma公司，巴比妥鈉孵育緩沖液購自美國ABI公司，RPMI 1640培養基購自美國Corning公司，恒溫培養箱購自德國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3.2 細胞轉染和分組取肺癌A549細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。取對數生長期的肺癌A549細胞接種于6孔板，每孔1×105/ml。待細胞貼壁，按照試劑盒說明書將WISP2蛋白過表達的載體轉染至肺癌A549細胞，作為觀察組，未轉染的肺癌A549細胞作為對照組。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布情況取NSCLC組和對照組肺癌A549細胞，胰蛋白酶消化后，乙醇洗滌，1000 r/min離心15 min后，300 μl胎牛血清重懸細胞，加入預冷的70%乙醇5 ml，4℃固定過夜，收集細胞，加入PI染色液500 μl，4℃避光孵育30 min后，過300目篩網，采用200 μl的胎牛血清再次重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況采用Annexin V-FITC/PI雙染法，將NSCLC組和對照組肺癌A549細胞轉移至離心管，胰蛋白酶消化后，1000 r/min，離心5 min，除去上清液。加入1 ml預冷的胎牛血清重懸細胞，加入1 ml預冷的巴比妥鈉孵育緩沖液和5 μl的Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μl的PI染色液，4℃避光孵育30 min后，過300目篩網，采用200 μl孵育緩沖液重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料的比較采用Mann-WhitneyU檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WISP 2蛋白表達情況的比較

NSCLC組織中WISP2蛋白的陽性表達率為51.67%（31/60），低于癌旁正常組織的70.00%（42/60），差異有統計學意義（χ2=4.232，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中WISP 2蛋白表達情況

不同年齡、性別NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同吸煙情況、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移情況NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 細胞周期分布情況的比較

觀察組肺癌A549細胞G1期細胞比例明顯高于對照組細胞，S期和G2期細胞比例均明顯低于對照組細胞，差異均有統計意義（P＜0.01）。（表2）

2.4 細胞凋亡情況的比較

觀察組肺癌A549細胞的凋亡率為（5.55±0.69）%，明顯高于對照組細胞的（3.05±0.43）%，差異有統計意義（t=19.026，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中WISP 2蛋白表達情況（n=60）

表2 兩組肺癌 A549細胞周期分布情況的比較（±s）

表2 兩組肺癌 A549細胞周期分布情況的比較（±s）

組別G1期S期G2期觀察組對照組t值P值60.12±7.15 40.99±5.28 13.158 0.000 25.72±3.88 37.32±4.55 11.447 0.000 14.15±1.94 21.69±3.81 10.083 0.000

3 討論

相關研究顯示，惡性腫瘤的發展過程由多種因素、多個步驟共同作用，正常細胞在與外界接觸或自身因素的刺激下，逐漸惡性增殖、分化，最終進展為惡性腫瘤細胞[8-10]。腫瘤細胞與腫瘤基質成分可共同參與腫瘤細胞的浸潤和轉移過程，在此過程中，細胞表面黏附分子的改變也發揮了重要作用，與腫瘤細胞的生物學行為密切相關[10-11]。表明腫瘤細胞的形成過程較為復雜，其特異性生物學行為隨腫瘤類型的不同而產生變化[12]。相關研究顯示，NSCLC早期癥狀不明顯，多數患者就診時已處于晚期，失去了最佳的手術時機，導致肺癌患者的生存率較低、病死率較高[13-14]。因此，早期診斷NSCLC，研究其發病機制，并對其腫瘤細胞的生物學行為進行探討，對提高NSCLC患者的生存率具有重要臨床意義。相關研究顯示，WISP2蛋白可抑制肺癌A549細胞的增殖[15]，具有一定臨床價值，本研究主要探討WISP2在NSCLC中的表達情況及對肺癌細胞生物學行為的影響，現報道如下。

研究顯示，WISP2是一種抑癌基因，可編碼多種細胞外基質蛋白，調控細胞增殖、分化和凋亡過程，對骨骼、神經及血管的發育具有抑制作用[16-18]。WISP2含有28個半胱氨基酸，可參與多種重要的生物學過程。研究顯示，WISP2在NSCLC的發生發展中發揮重要作用，WISP2可作為臨床治療NSCLC的重要靶蛋白[19]。臨床探討WISP2在NSCLC中的表達情況及相應的生物學行為對NSCLC的早期診斷、治療和預防提供了理論依據[20-21]。

本研究結果顯示，NSCLC組織中WISP2蛋白的陽性表達率為51.67%，低于癌旁正常組織的70.00%，差異有統計學意義（P＜0.05）。推測WISP2蛋白的表達情況與NSCLC的發生發展可能有關。本研究結果顯示，不同吸煙情況、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移情況NSCLC患者NSCLC組織中WISP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；觀察組肺癌A549細胞G1期細胞比例明顯高于對照組細胞，S期和G2期細胞比例均明顯低于對照組細胞，觀察組細胞的凋亡率也明顯高于對照組細胞。表明WISP2可對腫瘤細胞的周期分布和凋亡進行調控，有助于NSCLC的早期診斷并對其惡性程度進行評估，為NSCLC的治療提供參考。

綜上所述，WISP2在NSCLC組織中表達水平較低，其在NSCLC的發生發展過程中發揮重要作用。