補腎填精方對Lewis肺癌細胞增值及凋亡的影響*

華杭菊 張麗楓 任麗萍 盧麗莎 鄭 艷 陳武進

肺癌是常見惡性腫瘤之一，近年來，因氣候環境變化及飲食習慣的改變，其發病率及死亡率逐年上升，根據2017年國家癌癥中心的數據顯示，肺癌是目前致死原因第一的惡性腫瘤，是男性常見腫瘤發病率第一位[1]。雖然目前腫瘤治療手段越來越豐富，但其整體預后仍然很差，5年生存率不足20%[2]。而中藥復方因其多靶點、多途徑特點，大量研究顯示，復方中藥特別是補益類可改善機體免疫功能，提高生存質量等而廣泛應用于臨床。基于“腎生骨髓”“腎虛致瘤”及現代醫學認為骨髓是免疫活動細胞的主要源泉，故中醫學腎本質與免疫有著密切的關系。因此，進一步探究補腎填精方中藥復方對 Lewis 肺癌及其T細胞增殖能力影響，探討補腎填精方改善肺癌細胞腫瘤免疫微環境，抑制細胞增值和誘導細胞凋亡提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和 Lewis 肺癌細胞株SD大鼠20只，鼠齡6～8周，雄性，體質量(20±2)g；動物級別SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號: SCXK(滬)2017-0003。飼養于福建中醫藥大學實驗室動物房；室溫25℃，濕度70%，國家標準固體混合飼料喂養，小鼠自由采食和飲水。小鼠Lewis肺癌細胞株購自南京凱基生物科技發展有限公司，RPMI1640培養液(含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 U/ml的鏈霉素、pH=7.2)培養，培養箱保持條件為：37℃、5%CO2及飽和濕度。每隔1天進行培養基換液，每3 d傳代1次。

1.1.2 主要試劑及儀器補腎填精方(枸杞子、制何首烏和淫羊藿)按照藥物計算劑量: 枸杞子30 g,制何首烏30 g和淫羊藿30 g。福建中醫藥大學附屬人民醫院中藥房購買，浸泡2 h后，煎煮1 h，二煎8倍量蒸餾水，煎煮1 h，合并煎液，過濾，濃縮，超速離心后，繼續濃縮，離心噴霧干燥器制粒。用蒸餾水溶解稀釋至所需濃度。DMEM 購自Hyclone公司，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清購自美國Gibco公司，CO2細胞培養箱香港力康儀器設備有限公司，CKX41 倒置顯微鏡為日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備SD大鼠共20只，隨機分為補腎方中藥低、中、高劑量組以及NS對照組4組。分別為15.75、31.50、63.00 g·kg-1(即按照70 kg體質量的成人臨床用量的1倍、2倍、4倍)(并根據不同種屬間劑量等效折算表換算)，水煎煮后，將藥物濃縮至含生藥0.79、1.58、3.16 g·ml藥液大鼠灌胃給藥，每次2 ml灌胃，每日2次給藥；對照組給予0.9%NS，每日2次,每次2 ml。4組均連續灌胃給藥5 d，末次給藥結束后2 h，10%水合氯醛ip麻醉，在無菌環境下腹主動脈取血，4℃靜置3 h，離心分離血清。將同組血清合并，并置56℃水浴滅活30 min，0.22 μm針頭濾器過濾除菌，1 ml EP管無菌分裝，-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 細胞培養及藥物干預制備Lewis肺癌細胞懸液，按常規細胞培養方法培養Lewis肺癌細胞，予擴增第6～8代生長良好的Lewis肺癌細胞進行實驗。共分為4組，每組6個復孔，1×106個/孔接種于96孔板中，予含10%胎牛血清的BPMI1640培養液培養細胞24 h，培養液吸凈，無血清RPMI1640培養液每培養孔加入200 μl，繼續培養箱內培養24 h，使Lewis肺癌細胞同步化。再分別以含10%對照大鼠血清及低、中、高補腎方含藥血清的RPMI1640培養Lewis肺癌細胞，每孔200 μl。

1.2.3 CCK8檢測T細胞增值能力含藥血清藥物干預后加入10 μl CCK8：培養1～4小時。測定450 nm吸光度：檢測波長450～490 nm，參比波長600～650 nm。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期取生長狀態良好的Lewis肺癌細胞配制成密度為1.0×105/ml接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入不同濃度(低、中、高劑量組以及NS對照組)含藥血清1 ml，細胞培養箱內繼續培養72 h，予不含EDTA的胰蛋白酶后，收集置1.5 ml離心管后離心5 min，0.9%NS清洗2次，棄上清，加入預冷的70%乙醇1 ml，固定4℃過夜。固定液，PBS清洗2次，加4 ℃預冷PBS 500 μl重懸細胞，后加RNase A、PI避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期情況。

2 結果

2.1 補腎填精方含藥血清干預抑制Lewis肺癌細胞的生長采用倒置顯微鏡觀察低、中、高濃度含藥血清干預對細胞密度的影響。Lewis肺癌細胞接種后，分別給予對照組、低劑量、中劑量和高劑量的補腎填精方含藥血清干預細胞24 h后，在10×和20×的顯微鏡下觀察細胞密度。與對照組相比，不同濃度的含藥血清干預顯著降低肺癌細胞密度，濃度越高，抑制越明顯。實驗結果見圖1。

圖1 顯微鏡觀察Lewis肺癌細胞密度的影響

2.2 對Lewis肺癌周期的影響與正常對照組比較，實驗組3組均可顯著增加G2/M期細胞的百分比(P<0.05)，根據實驗結果顯示，高劑量補腎填精方組G2/M期細胞百分比為最高(15.59%)，這提示補腎填精方含藥血清可以通過誘導細胞周期阻滯到G2/M期從而抑制Lewis肺癌細胞。見表1。

表1 補腎填精方作用于A549細胞72 h細胞周期時相分布 (只，

注：與對照組比較，1)P<0.05

2.3 補腎方干預顯著抑制Lewis肺癌T細胞活力采用CCK-8檢測補腎方含藥血清干預對Lewis肺癌T細胞活力的影響。Lewis細胞分別經不同濃度的補腎方含藥血清干預24 h后，采用CCK8檢測細胞活力，與對照組相比，P<0.05。與對照組(100%)相比，不同濃度的補腎方含藥血清干預能夠顯著降低Lewis肺癌細胞的活力，且呈現劑量依賴(P<0.05)。可見，補腎填精方含藥血清具有顯著降低Lewis肺癌細胞活力的作用。實驗結果見圖2。

圖2 CCK-8檢測補腎方含藥血清干預對Lewis肺癌細胞活力的影響

3 討論

肺癌屬于中醫學“胸痛、喘證、肺積、哮證、咯血、咳嗽”等范疇。肺為腎之母，肺癌發病日久，子病及母，久則腎精耗傷，腎氣腎陰陽虧虛，反致肺臟虧虛，肺失宣降失職，外邪侵襲，留置肺絡，痰濕、瘀血內阻成瘤。肺腎虧虛，痰濕瘀血內阻為肺癌形成的主要病機之一。腎藏精，為先天之本，腎主一身陰陽，為元陰元陽之守；而腎為水，肺為金，金能生水，水能潤金，故金水相生法、補腎培元為肺癌治療大法。《素問·陰陽應象大論》說:“腎生骨髓”。及目前“腎虛致瘤”學說。目前研究顯示，腎虛影響機體免疫功能，補腎能提高機體免疫功能[3]。免疫功能與中醫學的腎主骨生髓密切相關，現代研究中認為骨髓干細胞有造血功能，體液及細胞免疫調節免疫反應，皆是中醫學“腎”功能的一個組成部分。而腎主封藏失職，則能量失守，能量失守是腫瘤發生的根本原因。

本實驗中補腎填精方由枸杞子、制何首烏和淫羊藿三味藥組成，方中枸杞子性味甘平，歸肝腎經，具有滋補肝腎，精血明目之功。近代研究發現枸杞子含有的枸杞多糖通過調節細胞因子表達影響T細胞免疫[4]。梁淑軒等[5]將枸杞多糖硒化后發現其抗腫瘤能力更顯著，且呈劑量依賴性。何首烏味苦甘澀，性微溫，歸肝腎經，具有補肝腎、益精血，強筋骨之功。《本草綱目》謂之能養血益肝，固精益腎，為滋補良藥，不寒不燥，功在地黃、天冬諸藥之上”。制何首烏多糖[6]具有增強巨噬細胞吞噬能力，具有較好增強免疫功能。淫羊藿味辛、甘，性溫，具有補腎壯陽，強筋健骨的功效。現代研究證實，淫羊藿苷可通過調節細胞周期調節Caspase-3、9，周期蛋白A、B1，CDK2，p21等蛋白及基因表達從而發揮抗腫瘤作用[7]。其提取物淫羊藿苷可通過恢復T細胞功能，提高機體免疫功能，進而產生抗腫瘤免疫[8，9]。基于腎為水火之宅，內有人體陰陽之源，三藥合用，枸杞子、制何首烏補腎中之陰，淫羊藿補腎中之陽，立足于補益腎氣，共奏補腎調元，培補陰陽，金水相生之效。

在內外因素下，機體功能失調，內環境紊亂，特別是機體免疫功能及免疫微環境的破壞是導致腫瘤發生及發展的主要原因。基于調整腫瘤免疫微環境的治療大法，肺癌的免疫治療已經廣泛運用于臨床，療效確切。而中醫學大量研究證實，金水相生法可明顯改善肺部癥狀。因此，其機理可能與金水相生法能改善機體免疫功能，誘導細胞凋亡有關。本研究證實補腎填精方對肺癌細胞具有一定的抑制作用，其中以高劑量中藥組對肺癌細胞影響效果更佳。從CCK檢測T細胞增值能力，提示高劑量的補腎填精方對肺癌細胞有抗腫瘤免疫調節作用。與對照組相比，P<0.05。補腎填精方含藥血清可以通過誘導細胞周期阻滯到G2/M期從而抑制Lewis肺癌細胞生長。

毋庸置疑，一定劑量的補腎填精方對Lewis肺癌細胞具有一定的腫瘤抑制作用，根據對T細胞活檢影響，我們推測補腎填精方對Lewis肺癌細胞可能具有抗腫瘤免疫調節作用，改善腫瘤的免疫微環境作用。但其抗腫瘤通過哪些信號通路機理不明，后期研究中將進一步明確其機理，以期能更好地運用于臨床，發揮中醫抗腫瘤優勢。