高血壓患者血清微小RNA-150的表達水平、生物學功能及其與心肌纖維化的關系▲

梁 珊 何亞州 李麗娟 黃彩依 歐陽雅蓉 傅為武 王慶高

(1 廣西中醫藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱：594103780@qq.com；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院心血管科，南寧市 530023)

高血壓可引起以血管和組織間隙纖維化為特征的心肌損傷，進而導致心肌組織硬化和心力衰竭。近年來，隨著心血管疾病的發病率及病死率逐漸升高，防治心肌纖維化對控制高血壓性心臟損害的發展及改善疾病預后具有重要意義[1-2]。人類微小RNA(microRNA，miRNA)為非編碼RNA，目前研究顯示多種RNA與心血管疾病關系密切[3]，其中miRNA-150在合并心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4]，但其在高血壓心肌纖維化病理改變中的機制尚不明確。有學者發現，miRNA-150在高血壓患者及健康人群外周血中的表達存在差異，其與心肌梗死等心血管疾病相關[5]。本研究檢測高血壓患者血清miRNA-150水平，并對其進行生物信息學分析，旨在探討miRNA-150表達水平與高血壓患者心肌纖維化的相關性及可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年9月廣西中醫藥大學第一附屬醫院心血管科一區收治的5例高血壓患者為觀察組，其中男性3例，女性2例，中位年齡50歲。納入標準：(1)高血壓診斷符合《中國高血壓防治指南(2009年基層版)》[6]中的標準：收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg；(2)首診為高血壓病，未服用藥物治療。排除標準：繼發性高血壓；合并肝、腎、肺等其他臟器系統纖維病變；患有冠心病、肢端肥大癥、糖尿病。選取同期在我院進行健康體檢的5例健康人為健康對照組。本研究獲本醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：觀察組于入院當天清晨，對照組于體檢當天清晨，采集空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置1 h，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝至1.5 mL無RNA酶EP管中，所有樣本均置于-80℃保存備用，1個月內進行檢測。

1.2.2 試劑與儀器：RNA提取試劑盒(批號：DP501)、反轉錄試劑盒(批號：KR201)、實時熒光定量PCR反應試劑盒(批號：FP401)均購自天根生物科技有限公司；Ⅰ型膠原(批號：ml1027777-2)、Ⅲ型膠原(批號：ml1057474-2)及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)蛋白(批號：ml1057824-2)試劑盒；使用酶標儀購自美國Thermo Fisher公司(型號：1510-01209)，實時熒光定量PCR儀購自美國應用生物系統公司(型號：ABI7500)。

1.2.3 血清miRNA-150的檢測：(1)提取血清總RNA。(2)將RNA 3′末端行加Poly(A)處理，在冰上預冷反應管(內含無RNA酶的水)，根據反轉錄試劑盒說明書加入試劑至總體積20 uL，用移液器輕輕混勻反應液，室溫下1 000 r/min離心30 s后，在37℃下反應60 min，將合成的cDNA反應液置于-20℃保存。(3)根據實時熒光定量PCR反應試劑盒要求配置反應體系，然后采用PCR儀進行實時熒光定量PCR反應，反應程序按照預變性95℃ 2 min，PCR反應95℃ 20 s，62℃ 34 s，共進行40個循環擴增。采用GraphPad 6.2軟件進行分析，根據2-△△CT公式計算出各樣品的目的基因相對表達水平。其中以U6為內參基因，內參及目的基因引物序列見表1。實驗步驟均嚴格按照試劑盒及儀器說明書進行操作。

表1 上游引物序列

1.2.4 血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平檢測：采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗進行檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作，使用酶標儀測定樣本在450 nm波長處的吸光度，根據標準品吸光度值及濃度繪制標準曲線，根據曲線方程換算成樣本蛋白濃度，每個樣本重復測量兩次，結果取平均值，結果采用GraphPad 6.2軟件進行分析。

1.2.5 miRNA-150生物信息學分析：在TargetScanHuman 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)數據庫檢索miRNA-150靶基因。利用網頁工具Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對上述3個數據庫檢索出的靶基因進行取交集處理。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)的基因功能分類工具(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)及功能注釋工具(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)和KOBAS 3.0網頁工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php)，對此基因集進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析。以P<0.05為差異有統計學意義，按P值大小從小到大排序，P值越小，富集程度越高。

1.3 統計學分析 應用GraphPad 6.2軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA水平比較 與健康人相比，觀察組患者的血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均升高(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平比較(x±s,pg/mL)

2.2 兩組血清miRNA-150的表達水平比較 觀察組患者miRNA-150相對表達水平為0.77±0.05，低于健康對照組的1.46±0.18(t=8.618，P<0.001)。

2.3 miRNA-150靶基因預測結果 利用TargetScanHuman 7.1、miRWalk3.0、miRDB數據庫分別檢索到351個、2204個、380個靶基因，取交集后得到30個共同靶基因，包括ZEB1、ACBD3、RAD23B、CTNNB1、NR1D2、CERS3、METAP1、PPP2R4、DCAF6、CDK13、FAM134C、MBTD1、ELOVL1、UBFD1、 POM121C、BASP1、ACTR1A、WDR5B、PAPPA、EGR2、GOSR1、PRICKLE2、ETF1、CBL、SP1、CALU、ENSA、ADIPOR2、PRRT2、 KLHL3。

2.4 miRNA-150靶基因的GO功能富集分析結果 所獲靶基因主要富集于脂筏特征蛋白復合物、細胞質、蛋白質-DNA復合物、核膜等細胞組分，與轉錄調控區DNA結合、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、鋅離子結合等分子功能有關，涉及妊娠、轉錄的正負調節等生物過程。見表3。

表3 miRNA-150靶基因的GO功能

注：*基因比例為涉及靶基因數量占當前功能類別識別基因總數的百分比。

2.5 miRNA-150靶基因KEGG信號通路富集分析結果 miRNA-150靶基因富集于50條通路，取P<0.05后篩選出15條信號通路，其中涉及上皮細胞侵入、Wnt信號通路、多種癌癥的發生發展過程，見表4。

表4 miRNA-150靶基因KEGG通路富集分析結果

3 討 論

高血壓心肌纖維化是由持續的壓力超負荷引起的心肌纖維化改變，是高血壓性心臟病心肌重構的主要病理特征，病理上表現為心肌成纖維細胞異常增殖、細胞外基質病理性積聚，體現為膠原沉積增多、比例失調(Ⅰ型、Ⅲ型膠原比例增加)和排列紊亂[7]。此外，近年來有研究表明，α-SMA可作為心肌成纖維細胞轉化成肌成纖維細胞的標志物[8-9]。另有學者發現，與同源正常血壓大鼠相比，自發性高血壓大鼠尾動脈壓及心肌中膠原沉積均顯著升高[10]。本研究結果亦顯示，高血壓患者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA表達水平均高于健康對照者(P<0.05)，這提示高血壓患者可能合并心肌纖維化。miRNA為由18～25個核苷酸構成的內源性非編碼RNA。有研究顯示，miRNA-150在患有心房顫動的收縮期心力衰竭患者的血小板中表達降低[4]。此外，Deng等[11]發現，miRNA-150能通過調節轉錄因子c-Myb而影響壓力超負荷引起的心肌纖維化。本研究中，與健康對照者比較，高血壓患者血清miRNA-150表達下調(P<0.05)。由此可推測，miRNA-150下調可能與高血壓患者發生心肌纖維化相關。

鋅離子與心肌纖維化關系密切，其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是與變性、降解纖維膠原和細胞外基質的其他組分相關的含鋅酶家族[12]。研究表明，抑制MMP可調節細胞外基質重塑和心臟衰竭的進展[13]。此外，去氧腎上腺素誘導的復合物1轉錄因子為鋅指蛋白中的一員，其能通過半胱氨酸和組氨酸來結合鋅離子，形成“鋅指結構”而識別及結合DNA，其還參與調節心臟纖維化和細胞外基質轉化，并影響MMP-9基因的表達[14]。本研究的生物信息學分析結果顯示，miRNA-150靶基因與鋅離子結合有關，這進一步反映了miRNA-150靶基因與高血壓患者發生心肌纖維化密切相關。

Wnt信號通路與細胞生長、增殖和凋亡等生物學功能相關，其中Wnt對心肌成纖維化細胞的激活，細胞外基質的沉積，以及心肌纖維化的發生發展，均有重要作用，且Wnt/β-連環蛋白經典信號通路尤為重要[15]，Xiang等[16]研究發現，小鼠心肌成纖維細胞中Wnt/β-連環蛋白信號通路的活化以及β-連環蛋白的激活，均對分泌胞外基質的基因表達具有重要作用，雖然沉默β-連環蛋白不改變體內活化或分化的心肌成纖維細胞數量，但其對保留壓力超負荷小鼠的心臟功能，減少心臟間質纖維化具有積極意義。還有學者發現，通過上調Axin2和Wnt3a以激活經典Wnt/β-連環蛋白信號通路，可誘導小鼠心肌成纖維細胞增殖，并影響MMP-13基因的表達以及MMP-2和MMP-9的酶活性，加速細胞胞外膠質重塑[17]。此外，Wnt信號通路在心肌纖維化機制中作用復雜，與多條心肌纖維化相關信號通路如轉化生長因子β通路等相互串聯[18]。而本研究中，KEGG信號通路分析提示miRNA-150的靶基因涉及Wnt信號通路，提示miRNA-150可能通過調節Wnt信號通路參與高血壓心肌纖維化的發生。

綜上所述，高血壓患者血清miRNA-150表達下調，這可能通過調節Wnt信號通路參與了心肌纖維化的發生。但由于本研究樣本量的限制與生物信息學分析的局限性，仍需擴大樣本量進行進一步研究，并利用體外實驗對miRNA-150進行抑制或過表達，配合免疫印跡法及熒光定量實驗對通路蛋白及基因進一步驗證，以期為高血壓心肌纖維化機制的研究及疾病防治提供參考依據。