扶正化瘀膠囊抗肝纖維化作用研究

李厚鋼 湖北省藥品監督檢驗研究院 郭有愛 長江職業學院

《全球癌癥報告 2014 》顯示，中國新增和死亡病例世界第一，每年約 250 萬人死于癌癥（肝癌），占世界肝癌總死亡人數的 51%。由肝纖維化引起各種病因的慢性肝病導致患者中的 25%～ 40%最終惡化為肝硬化乃至肝癌。肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指由各種致病因子所致肝內結締組織中肝星狀細胞(HSC)增生導致肝內細胞外基質(ECM)過度沉淀的病理過程。肝纖維化細胞的特點：具有增殖性、纖維原性、可收縮性的肌成纖維樣細胞。本實驗室前期研究證明肝纖維化的進程是可逆的，但抗肝纖維化的作用機理未知。本實驗旨在研究扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機理，為后續課題組對抗肝纖維化作用機理研究提供一定的依據。

1 實驗材料

1.1 受試藥物及其配制方法

扶正化瘀膠囊：0.3g/粒，國藥準字Z20020073，批號：170109，上海黃海制藥有限責任公司。臨用前稱取扶正化瘀藥物粉末0.2925g溶于10ml溫水中即得。

30%CCL4：CCL4溶液與食用油按照3:7的比例混勻。

秋水仙堿：0.5mg/粒，國藥準字H20113208，批號：20161004，廣東彼迪藥業有限公司生產。臨用前稱取0.2mg溶于10ml純水中，即得。

0.9 %氯化鈉注射液：國藥準字H20043320，批號：161224510，武漢福星生物藥業有限公司生產。

1.2 實驗動物

SPF級KM小鼠，雄性，共96只，體重18～20克，由武漢生物制品研究所有限責任公司提供，實驗動物生產合格證號：SCXK（鄂）2012-0013。

1.3 實驗動物飼養管理環境

實驗動物飼養SPF級環境，實驗動物使用許可證：SYXK（鄂）2014-0009。自由飲用凈化水，光照為12h明暗交替，溫度為22～24℃，相對濕度50～70%。

2 儀器與試劑

2.1 試劑

10%中性甲醛、四氯化碳均購買于國藥集團化學試劑有限公司；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；食用油為金龍魚食用油。

2.2 儀器

石蠟切片機（Finesse E+，賽默飛世爾）；烤片機（High Capacity Dryer，賽默飛世爾）；包埋機（Histo Star，賽默飛世爾）；包埋盒打號機（Printmate 150，賽默飛世爾）；脫水機（Excelsior ES，賽默飛世爾）；動物秤（DS-671，上海金山亭衡衡器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（BX53，OLYMPUS）；全自動生化分析儀（AU400，OLYMPUS）；臺式低溫高速離心機（3K15，德國SIGMA）。

3 實驗方法

3.1 動物分組與給藥

KM小鼠適應環境5天后，按隨機數表法隨機分為空白對照組、模型對照組、扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組。除空白對照組給予0.9%氯化鈉注射液外，剩余小鼠均給予30%CCL4腹腔注射，造模與治療同時進行，灌胃體積20ml/kg，每周2次，共計4周。

實驗期滿，所有小鼠禁食不禁水12h，取血，分離血清并采集組織樣本。

3.2 一般情況觀察

觀察小鼠進食、存活、活動狀態、毛色光澤度、排便等情況。

3.3 病理形態觀察

蘇木精-伊紅染色（HE），觀察小鼠肝纖維化的程度，倒置熒光顯微鏡觀察肝組織切片的超微結構。

從肝左葉中部切取厚度約2mm的肝組織，用10%中性甲醛固定。將固定好的肝組織依次放置于脫水機按照“70%乙醇3h，80%乙醇 2h，90%乙醇 2h，95%乙醇 2h，100%無水乙醇（Ⅰ）30min,100%無水乙醇（Ⅱ）30min，二甲苯（Ⅰ）20min，二甲苯（Ⅱ）20min”的設定程序進行脫水，然后依次置于包埋機、包埋打號機中包埋染色、打號，于烤片機中烘干后用切片機切制厚度為5μm的切片。用Progres CapturePro2.8.8顯微圖像處理系統觀察并收集圖片，比較各組肝臟組織形態變化。

3.4 肝功能生化檢測

小鼠取血后室溫靜置1h，12000r/min，離心10min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）堿性磷酸酶（ALP）。

4 統計學處理

計量數據均以均數±標準差表示，用SPSS16.0進行統計學分析，不同組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05時，差異具有統計學意義。

5 結果

5.1 一般情況觀察

空白對照組，小鼠活動正常，毛發有光澤，飲食量正常；模型組，小鼠活動減少，精神萎靡，毛發無光澤，尿液黃色，大便稀溏，有腹瀉，飲食量減少，小鼠喜歡縮在角落里；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組小鼠活動程度、飲食量和毛發光澤程度均好于模型組；秋水仙堿給藥組小鼠給藥期間發生過小鼠廝打現象。實驗期間，空白對照組小鼠無死亡，死亡率0%；模型對照組小鼠死亡9只，死亡率37.5%；扶正化瘀給藥組小鼠死亡2只，死亡率8.3%；秋水仙堿給藥組小鼠死亡9只，死亡率37.5%。為方便統計學統計，各組均取10只小鼠進行相關指標的檢測。

5.2 肝病理形態觀察

空白對照組肝小葉結構清晰完整，肝細胞多呈單核，以中央靜脈為中心呈放射狀排列；肝纖維化模型組小鼠肝小葉有大量的炎性細胞；扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比，其纖維化程度明顯減輕，炎性細胞侵潤程度減小，與空白對照組相比，其肝纖維化程度明顯增強，表現為肝細胞排列紊亂，細胞和有炎性細胞侵潤；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組肝纖維化程度相比較，秋水仙堿給藥組纖維化程度明顯減輕，表現為肝小葉結構輕度紊亂、排列恢復。

圖1 HE染色（×40）

5.3 血清生化學指標檢測

血清生化學結果顯示（表1），肝纖維化模型組（CCL4組）較空白對照組ALT、AST、ALP值顯著升高（P＜0.05）；扶正化瘀給藥組和秋水仙堿給藥組與肝纖維化模型組相比ALT、AST、ALP值明顯下降，存在顯著差異（P＜0.05）；扶正化瘀給藥組與秋水仙堿給藥組的ALT、AST、ALP值相比雖然低但不存在顯著差異，無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表1 血清生化學指標

6 討論

本實驗采用30%CCL4制備小鼠肝纖維化模型， CCL4模型是一種典型的制備肝纖維化模型方法，具有耗時短的特點。造模成功后可見肝細胞以及血清生化指標發生顯著變化，ALT、AST、ALP是用于反映肝功能損傷或健康程度的基本指標，大量文獻中使用ALT、AST、ALP的頻率遠高于其他指標。

有文獻將體重或肝指數作為檢測指標，我們在實驗中發現，CCL4與油混用后，經過腹腔注射、皮下注射和灌胃后，油的成分均有滯留在動物體內的現象，使動物體重不同程度的增加。因此，我們認為將體重或肝指數作為檢測指測指標不具有研究意義。

有文獻報道小鼠肝纖維化模型制備后，存在一定的自愈傾向。為了驗證這一結論，我們額外增加了一項預實驗，另取18只KM小鼠，分為空白對照組、模型對照組和自愈組，空白對照組給0.9%氯化鈉，模型對照組給30%CCL4，除自愈組在第4周末次給藥后保留外，剩余兩組全部處死，取肝組織固定保存，自愈組每繼續經過1周處死一只，觀察肝組織形態變化。發現在制備模型成功后，肝纖維化小鼠存在極弱的自愈能力，小鼠的肝組織形態幾乎無變化。

秋水仙堿作為西藥中的合成藥物，作用見效快，但死亡率高，不利于肝纖維化治療的用藥安全。中藥是以中醫理論為指導，按中醫治療原則使用的貨真質優的藥材，包括中藥材、中藥飲片和中成藥。隨著中醫、針灸在西方世界的發展,中藥也受到了青睞。相對于毒副作用高的西藥，中藥毒副作用小、開發潛力巨大，但其作用機理的闡明仍需繼續研究。