七氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠行為學及海馬中BDNF表達的影響

牛佳媛，吳子怡，薛杭，李星樾，李暢，趙平

（中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉科，沈陽 110004）

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是指圍產期由于各種因素引起的新生兒缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）綜合征，是造成新生兒中樞神經系統異常及早期死亡的重要原因之一［1］。目前臨床應用最廣泛的治療方法是亞低溫結合其他對癥治療，然而療效并不顯著［2］。七氟醚作為一種新型的吸入麻醉藥，具有誘導速度快，刺激性小，血流動力學穩定等優點，廣泛應用于嬰幼兒全身麻醉誘導及術中維持。研究［3］表明，七氟醚后處理能減少神經元損傷，發揮對新生大鼠HIBI的保護作用，但是對于大鼠運動活動度、情緒等遠期行為學的相關研究甚少。本研究通過曠場實驗、Morris水迷宮實驗，評估七氟醚后處理對HIBI新生大鼠的運動度、情緒及空間學習記憶能力的影響，并通過檢測海馬記憶相關蛋白——腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達水平，進一步探討七氟醚后處理對HIBI新生大鼠遠期行為學影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級新生7日齡SD大鼠，體質量12～16 g，由中國醫科大學附屬盛京醫院本溪醫藥研究教育發展基地提供，采用隨機數字表法將大鼠分為3組：假手術組（Sham組）、缺血缺氧模型組（HI組）、七氟醚后處理組（HIS組），每組10只。本實驗嚴格按照國際倫理準則以及國家衛生研究院實驗室動物護理與使用指南進行，并經中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會審查批準（2017PS020K）。

1.2 模型制備及干預

參照ZHAO等［4］的方法制備HIBI模型：面罩吸入七氟醚維持麻醉，顯微鏡下用7-0絲線2次永久結扎左側頸總動脈，縫合傷口且清醒后返回母鼠身邊繼續喂哺2 h，自制缺氧箱置于水浴箱中，水浴溫度為37 ℃，持續輸入8%O2+92%N2的濕化混合氣體（2 L/min）2 h。Sham組僅暴露左頸總動脈但不結扎，不進行低氧處理，其余2組均進行缺血缺氧處理。HIS組新生大鼠HIBI后即刻吸入由30%O2+70%N2濕化混合氣體輸送的2%七氟醚30 min，Sham組、HI組吸入不含七氟醚的30%O2+70%N2濕化混合氣體30 min。

1.3 曠場實驗

制模后28 d行曠場實驗。曠場實驗設備主要由1個50 cm×50 cm×40 cm 的黑色箱組成，底部被劃分為16 個虛擬正方格，沿側壁格為外周格（周邊區），其余為中央格（中央區），正上方有錄像檢測系統并與計算機分析軟件系統連接。將小鼠放在正中央區，系統開始同步自動記錄大鼠10 min穿越周邊區與中央區的時間、路程。每只大鼠實驗結束后清除箱內糞便，75%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布擦干，避免留有氣味影響其他大鼠結果。實驗結束后應用SMART系統對數據進行分析。

1.4 Morris水迷宮實驗

大鼠曠場實驗結束后行Morris水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗［5-6］。水迷宮為黑色壁圓形游泳池（直徑160 cm，深度60 cm），平均分為四個象限，第四象限內距池壁邊緣 30 cm 處隱藏逃生平臺（直徑12 cm），位于水面下約1.5 cm處，水溫控制在（20±1）℃，水池上方安裝有自動監視系統，同步記錄大鼠在水池里的運動情況。實驗前1 d分別將各組大鼠放入水池（不含平臺）中自由游泳90 s，使其熟悉水池環境。每天8：00行定位航行試驗，共5 d。大鼠面向池壁，按隨機順序分別從4個象限的入水點將其放入水中，強迫其尋找水下平臺。圖像監視系統自動追蹤記錄其從入水到爬上平臺的總路程及爬上平臺所需的時間，即逃離潛伏期，如果大鼠在 90 s 內自行找到平臺則讓其在平臺上停留 20 s，再進行下一只大鼠實驗；如果入水90 s 內不能找到平臺，則將大鼠引導上平臺并使其停留 20 s，此時認定其逃逸潛伏期為 90 s。每天測定 4 次，每次間隔時間至少 30 min，計算4 次逃離潛伏期時間的平均值。每次試驗結束后將大鼠擦干后放回籠中，注意保暖，自由飲食水；每個訓練日結束后清理水迷宮更換新水以消除嗅覺與環境因素的干擾。定位航行實驗結束后1 d，將平臺從迷宮中移除，行空間探索實驗：將大鼠放置于第二象限入水點，大鼠90 s內游過平臺區域的次數為穿越平臺次數。

1.5 蛋白免疫印記檢測

大鼠完成行為學實驗后，每組取5只大鼠，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。恒定電流電泳分離，然后以200 mV恒定電壓濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后，TBST 洗膜，加入兔抗鼠BDNF多克隆抗體（1∶1 000，美國Abcam公司），4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3 次，每次10 min，山羊抗兔二抗（1∶2 000，中國中杉新橋公司）室溫孵育2 h，TBST洗膜3 次，每次10 min，ECL 發光，GADPH（1∶2 000，美國Proteintech公司）作為內參照。

1.6 免疫組織化學檢測

每組取3只大鼠，4%多聚甲醛灌流，石蠟包埋，連續切片。行免疫組化染色［BDNF（1∶500，美國Abcam公司）］。每只大鼠選取2張海馬冠狀面切片，在高倍顯微鏡（×400）下隨機選取CA1及CA3區3個不重疊的視野（50 μm×50 μm）進行觀察，BDNF陽性細胞胞質呈棕黃色，計算BDNF陽性細胞數目，取3個視野的平均值作為BDNF的表達水平。

1.7 統計學分析

實驗數據采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用LSD檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗結果

結果顯示，各組大鼠中央區停留時間、運動總路程、糞便數量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠中央區停留時間、運動總路程、糞便數量比較Tab.1 Comparison of the time spent in the central area，distance travelled，and number of fecal boli of rats from each group

2.2 Morris水迷宮實驗結果

結果顯示，與Sham組比較，HI組、HIS組大鼠潛伏期明顯延長（P＜0.05）；與HI組比較，HIS組潛伏期縮短（P＜0.05）。空間探索能力測試結果顯示，與Sham組比較，HI組、HIS組大鼠平臺穿越次數均減少（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組穿越次數增加（P＜0.05）。見表2。

表2 3組水迷宮實驗結果比較Tab.2 Results of the Morris water maze test among the three groups

2.3 3組大鼠海馬中BDNF表達比較

蛋白免疫印記結果顯示，Sham組、HI組、HIS組BDNF表達分別為1.00±0.55，0.21±0.18，0.83±0.23。與Sham組比較，HI組大鼠BDNF蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組BDNF蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。免疫組化結果顯示，神經元胞質染色為棕黃色表示BDNF陽性。Sham組、HI組、HIS組陽性神經元數分別為：CA1區，9.06±0.98，3.78±1.31，6.33±0.60；CA3區，9.72±0.83，3.56±0.66，6.50±0.62。與Sham組比較，HI組大鼠左側海馬CA1及CA3區陽性神經元數目明顯減少（P＜0.01）；與HI組比較，HIS組左側海馬CA1及CA3區陽性神經元數目增加（P＜0.01），與蛋白免疫印記檢測結果一致。見圖1。

3 討論

HIBI研究成功的關鍵是建立合適的缺氧缺血模型。本研究參照課題組前期實驗中改進后的經典Rice法［7］，將新生7 d大鼠行左側頸總動脈結扎并進行缺氧處理，從而構建了新生大鼠HIBI模型。

本課題組前期研究［4，8］表明，新生大鼠HIBI可導致遠期學習記憶功能障礙。本研究通過Morris水迷宮檢測證實，與Sham組比較，HI組逃逸潛伏期顯著延長，穿越平臺次數顯著減少，學習記憶能力明顯下降。而曠場實驗結果顯示了各組大鼠運動活動度與焦慮情緒的變化，各組大鼠運動總路程、中央區停留時間、糞便數量均無統計學差異（均P＞0.05），表明HIBI并未導致大鼠成年后出現運動活性降低及額外的焦慮情緒，也可以排除運動活性及焦慮情緒對大鼠學習記憶的影響。

近年來，大量研究［4，9］表明異氟醚后處理能夠減輕HIBI新生大鼠腦損傷程度，并且具有長期保護作用。而同屬于吸入麻醉藥的七氟醚，目前更常用于小兒麻醉的誘導與維持，最新研究［3］表明七氟醚后處理同樣對HIBI新生大鼠腦損傷具有神經保護作用，本研究通過Morris水迷宮實驗證實七氟醚后處理可以明顯改善HIBI新生大鼠遠期空間學習記憶能力，與LAI等［10］實驗結果一致。

圖1 各組大鼠海馬BDNF表達水平Fig.1 The expression of BDNF in the hippocampus of rats from each group

BDNF作為神經營養因子家族成員，廣泛分布于中樞和周圍神經系統中，對中樞系統神經元生長、分化及損傷修復至關重要［11］。研究表明，BDNF可誘導神經元生存及成熟，增強突觸信息傳遞，從而有利于信息存儲，提高記憶及認知功能［12-13］；空間學習記憶形成時BDNF表達水平增加，反之BDNF基因敲除則導致認知功能減退［14-15］。本實驗結果顯示與Sham組比較，HI組大鼠海馬組織中BDNF表達水平明顯降低，而七氟醚后處理可以提高BDNF表達水平，可見BDNF的表達與學習記憶能力程度相關，由此推論BDNF可能在七氟醚后處理改善HIBI新生大鼠遠期空間學習記憶能力過程中發揮一定的作用。

綜上所述，七氟醚后處理能促進HIBI模型大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達，從而改善HIBI新生大鼠的遠期學習記憶能力。本研究結果為七氟醚后處理對HIBI的保護作用及其分子機制奠定了研究基礎。