ILEI在腎間質纖維化中的表達變化

趙興，馬天嬌，羅鋼

（中國醫科大學附屬第一醫院兒科，沈陽 110001）

慢性腎臟病是一種威脅人類生命健康的“全球公共健康問題”，其病因復雜多樣［1］，腎臟纖維化是該病進展的共同結局［2］。研究［3］已證實，腎間質纖維化是導致腎臟纖維化的主要原因，是參與終末期腎臟病形成的共同通路，主導腎臟疾病的轉歸。目前，腎間質纖維化的發病機制尚不清楚，如何減輕或逆轉腎臟纖維化以延緩終末期腎病的發生已成為國內外研究的熱點。單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral occlusion，UUO）是引起梗阻性腎病的實驗動物模型，用于研究腎臟炎癥和瘢痕形成的各個方面，包括疾病的發病機制和潛在的抗炎或抗纖維化治療實驗［4］。研究［5］表明，上皮-間質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腎間質纖維化的發生、發展過程中起到至關重要的作用。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）被 公認為是參與EMT最重要的促纖維化因子［6］。本文研究的白細胞介素樣的EMT誘導因子（interleukin-like epithelial-mesenchymal transition inducer，ILEI）參與腫瘤細胞的侵襲、轉移等多種生物過程。本研究采用UUO小鼠和人近端腎小管上皮細胞（HK-2細胞），分別從體內及體外兩個方面探討ILEI是否參與腎間質纖維化的形成，以期豐富腎間質纖維化的分子理論基礎，為慢性腎臟病的治療開發新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性小鼠24只（美國癌癥研究所引進，中國醫科大學實驗動物中心提供），動物批號：SCXK（遼）2008-0005，3～4周齡，體質量18～22 g。HK-2細胞系（中國典型培養物保藏中心）。人TGF-β1（美國PEPROTECH 公司）；DMEM培養基（美國Gibco 公司）；胎牛血清（美國 Hyclone 公司）；ILEI抗體（英國Abcam公司）；凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（中國麥克奧迪公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及分組：選取4～6周齡SPF級健康雄性小鼠24只，于中國醫科大學實驗動物部適應性喂養1周。按體質量分層后隨機分為3組：假手術組、UUO模型7 d組、UUO模型14 d組，每組8只。0周時，以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進行腹腔注射麻醉，將小鼠固定于手術臺上，腹部備毛，正中左側旁切口，打開腹腔，暴露左腎，游離輸尿管。其中模型組小鼠在輸尿管近端及遠端分別以4.0絲線結扎，中間離斷關腹；假手術組僅游離左側輸尿管，不進行結扎；75%乙醇消毒切口。放入飼養籠內等待蘇醒，自由飲食。術后7 d處死8只小鼠，術后14 d處死余下小鼠，留取手術側腎臟組織用于后續檢測。

1.2.2 Masson染色：取小鼠腎臟組織固定48 h，脫水，透明，包埋，切片后烘干。染色前，切片脫蠟，梯度乙醇脫水，入Masson復合染液5 min，醋酸洗液洗片，磷鎢酸染色8 min，醋酸洗液再次洗片，甲苯胺藍染色3 min，醋酸洗液沖洗、經乙醇脫水、透明后封片。

1.2.3 免疫組織化學染色：小鼠腎組織石蠟切片，經枸鹽酸鹽修復，4 ℃下滴加一抗（1∶200）過夜后，37 ℃下滴加二抗孵育30 min，DAB顯色，脫水、透明、中性樹膠封片。ILEI陽性在鏡下呈棕黃色，進行定位分析。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統進行半定量分析，每張切片選取5個高倍視野，測平均吸光度，取均值作比較。

1.2.4 細胞培養：復蘇HK-2細胞后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃含有5%CO2培養箱中培養。待細胞生長狀態較佳時收集細胞，接種于T25塑料培養瓶中并分成正常對照組、5 ng/mL TGF-β1組、10 ng/mL TGF-β1組，每組3×105個細胞。置于37 ℃、5%CO2的培養箱內培養24 h，培養基更換為無血清DMEM，分別加入5和10 ng/mL的TGF-β1，將不添加TGF-β1處理組作為正常對照組。進行時間依賴性實驗時，控制每組TGF-β1處理濃度不變，將5 ng/mL TGF-β1組及10 ng/mL TGF-β1組細胞再置于37 ℃、5%CO2的培養箱內分別培養24、48及72 h。將各組細胞在相差顯微鏡（100×）下拍照。

1.2.5 Western blotting：提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度；制備SDS-PAGE膠，上樣，跑膠，轉膜，封閉，加一抗4 ℃孵育過夜（ILEI抗體稀釋比例為1∶1 000），加二抗37 ℃孵育45 min，加ECL液顯影，抗體剝脫，采用Gel-Pro-Analyzer凝膠圖像分析系統進行半定量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，小鼠腎組織中ILEI蛋白的表達水平以表示，采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 腎組織的病理改變

Masson染色光鏡下可見假手術組小鼠腎組織結構清晰，染色均一，未見明顯病變；UUO模型7 d組腎組織結構病變較為嚴重，部分腎小球皺縮深染，部分腎小管萎縮并出現藍色膠原蛋白沉積，伴有散在分布的血細胞浸出，腎小管上皮細胞腫脹，腎間質萎縮，間質區部分出現藍色膠原蛋白沉積；UUO模型14 d組腎組織結構病變嚴重，部分腎小球皺縮，部分腎小管萎縮，腎小管腔不可見，腎小管上皮細胞腫脹，可見空泡變性，細胞扁平，腎間質萎縮壞死，間質區大量藍色膠原蛋白沉積。見圖1。

圖1 腎組織Masson染色分析 ×200Fig.1 Masson staining of renal tissue ×200

2.2 免疫組織化學法檢測ILEI在腎組織中表達

光鏡下觀察每組小鼠的腎組織，假手術組小鼠腎組織中可見微量ILEI棕黃色陽性表達顆粒，UUO模型7 d組小鼠腎組織中ILEI棕黃色陽性表達顆粒明顯增多，UUO模型14 d組小鼠腎組織中ILEI棕黃色陽性表達顆粒減少。假手術組、UUO模型7 d組、UUO模型14 d組ILEI平均吸光度值分別為0.002 0±0.000 5、0.024 6±0.006 1、0.001 7±0.000 5（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ILEI表達的免疫組織化學分析 ×400Fig.2 ILEI expression analyzed by immunohistochemistry ×400

2.3 TGF-β1誘導腎小管上皮細胞形態改變

5 ng/mL TGF-β1處理HK-2細胞72 h后，應用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態變化。正常對照組HK-2細胞具有上皮細胞典型的鋪路石樣形態，為橢圓形或圓形。TGF-β1誘導后，HK-2細胞間隙增寬，細胞形態變長、變大，同倍率視野內的細胞數量減少。見圖3。

圖3 倒置顯微鏡下觀察TGF-β1誘導對HK-2細胞形態的影響 ×100Fig.3 Morphological changes in HK-2 cells treated by TGF-β1 observed under an inverted microscope ×100

2.4 TGF-β1誘導腎小管上皮細胞ILEI的蛋白表達

Western blotting結果證實：HK-2細胞幾乎不表達ILEI，經TGF-β1誘導后，其ILEI表達量逐漸增多。且隨著TGF-β1作用時間延長ILEI表達量逐漸升高，48 h達到高峰（P＜0.05），72 h與24和48 h比較明顯下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 不同濃度的TGF-β1作用HK-2細胞對ILEI蛋白表達的影響Fig.4 ILEI expression in HK-2 cells treated with TGF-β1 for different time periods and at different concentrations

3 討論

纖維化是多種慢性疾病進展到終末期時共同經歷的病理過程，腎間質纖維化是慢性腎臟病發展為終末期腎功能衰竭的病理表現。腎間質纖維化影響慢性腎臟疾病的預后并主導腎臟疾病的轉歸。肌成纖維細胞是一群位于腎間質、具有平滑肌細胞和成纖維細胞特征的一類細胞，同時也是產生細胞外基質的主要效應細胞。目前認為，腎間質纖維化以肌成纖維細胞增殖和活化、促進細胞外基質大量產生和異常沉積為特征［7］。據文獻報道，EMT與腫瘤侵襲、轉移［8］、復發［9］和器官纖維化等疾病的病理過程密切相關。EMT是間質肌成纖維細胞的重要來源，是腎臟纖維化形成的重要環節［10］。腎小管上皮細胞是最易受損的腎臟固有細胞，研究［11］表明，發生EMT的腎小管上皮細胞是肌成纖維細胞的主要來源之一，其維持和促進腎臟纖維化的作用已成為近年研究熱點。本研究針對慢性腎臟病腎間質纖維化的發生機制進行分子研究，為早期控制疾病進展及優化患者治療方案提供新思路。

EMT是指腎臟受損后，腎小管上皮細胞喪失了原有上皮細胞的表型，獲得間質細胞的形態和特征。這一過程包括4個關鍵環節：（1）上皮細胞失去黏附特性；（2）間充質細胞標志蛋白如α-平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白重新合成；（3）腎小管基底膜被破壞；（4）細胞的侵襲和遷移能力明顯增強［12］。有許多細胞通路激活并刺激 EMT 發生，如 TGF-β、成纖維細胞生長因子等。其中，TGF-β1作為最重要的促纖維化因子，是EMT的核心因子，啟動并調節EMT的全過程［12］。研究［13］已證明，幾乎所有慢性腎臟疾病的人類標本或動物研究模型中均可檢測到TGF-βl表達上調。

2002年發現的蛋白序列相似度為3的類細胞因子家族（family with similarity 3，FAM3）包括4個成員（FAM3A、FAM3B、FAM3C、FAM3D）。現有研究表明，FAM3基因家族成員可能在糖尿病、腫瘤等多種重大疾病的發生發展過程中起重要作用。FAM3C是FAM家族成員之一，又稱為ILEI，最初是作為參與常染色體隱性遺傳的非綜合征性聽力喪失的候選基因被發現，是視網膜形成的關鍵因子［14］。近年來，先后有學者發現ILEI在多種生物過程中發揮作用，包括阿爾茨海默病［15］、骨密度調控［16］、腎間質纖維化［17］以及腫瘤細胞的侵襲和轉移等［18］。

根據UUO小鼠模型Masson染色，可以觀察到假手術組小鼠腎組織中腎間質未見明顯病變，UUO模型7 d組小鼠腎間質區部分出現藍色膠原蛋白沉積，UUO模型14 d組小鼠腎間質區大量藍色膠原蛋白沉積，腎臟纖維化明顯，提示腎小管EMT模型制作成功。免疫組織化學結果顯示，與假手術組比較，UUO模型7 d組小鼠腎組織中ILEI表達量明顯增多，UUO模型14 d組ILEI表達量較前下降。在UUO模型建立數小時后黏附因子和趨化因子分泌增加，并持續7～10 d，此時是炎癥反應的高峰期，ILEI表達量升高明顯，說明ILEI很可能參與了該病變過程。

另外本研究發現，HK-2細胞被TGF-β1誘導后，其ILEI的蛋白表達量在48 h內也顯著增多。既往研究［19］已證實，TGF-β1能夠誘導HK-2細胞發生腎小管上皮細胞轉分化。本研究應用TGF-β1誘導HK-2細胞后，腎小管上皮細胞發生了形態學的改變，且隨著TGF-β1作用時間的延長，ILEI的表達量逐漸升高。因此，推測ILEI與TGF-β1誘導的腎小管EMT存在密切關系。

綜上所述，本研究的體內及體外實驗結果證實了ILEI在腎間質纖維化中表達量變化明顯，認為其參與腎間質纖維化的形成，在腎間質纖維化中扮演重要角色。