黃芪糖蛋白對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障作用的研究

張麗紅 ，郭敏芳，張慧宇，章培軍，邢雁霞，馬存根，薛慧清，趙海寶

（1.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；2.山西中醫藥大學基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室，太原 030619；3.大同市第三人民醫院病理科，山西 大同 037008）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種T細胞介導的主要累及中樞神經系統（central nervous system，CNS）白質的特異性炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，具有高致殘、高復發的特點。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE）是國際上公認的研究 MS 的理想動物模型。MS和EAE的基本病理過程相似，外周髓鞘抗原特異性T細胞通過分子模擬機制被初次激活，穿過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）進入CNS，之后被再次激活，釋放各種有害物質并誘發一系列瀑布樣異常免疫應答反應。近年來，我國MS的發病率呈不斷上升趨勢。西藥治療MS效果差，不良反應大，因此有不少學者致力于從中草藥中尋找有效的成分，積極探索尋找新的治療藥物。黃芪為豆科多年生草本植物的干燥根，具有補中益氣之功效，作為一種具有較強免疫調節作用的中藥，廣泛應用于免疫性疾病的臨床治療［1-2］。黃芪糖蛋白（Huangqi glycoprotein，HQGP）是從中藥黃芪中提取純化的一種天然植物糖蛋白，本課題組的前期研究［3-4］發現HQGP對EAE 小鼠有一定的抗炎作用，因此推測其對EAE的BBB可能具有保護作用，并可能是抑制炎癥細胞入侵，減輕臨床癥狀的重要原因。因此，本研究擬探討HQGP對EAE小鼠BBB通透性的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取健康清潔級雌性C57BL/6小鼠40只，8～10周齡，體質量18～22 g，于標準動物飼養室內飼養1周后制造EAE模型，所有動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.1.2 主要試劑：小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG 35-55）購自西安聯美生物科技有限公司；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）由瑞士Alexis公司提供；結核分支桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）購自美 國BD公 司；完 全Freund佐 劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）、兔抗小鼠CD4和CD68單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）購自英國AbD Serotec公司；Alexa Fluor 555 標記的山羊抗兔二抗購自美國Invitrogen公司。其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 EAE小鼠模型制備：隨機將C57BL/6雌性小鼠分為EAE組和HQGP組，每組20只。MOG35-55的配制與注射均嚴格參照文獻［5］進行，免疫當天記為免 疫 后0 d（the 0 day post-immunization，d0 p.i.），2組小鼠于d0 p.i.和d2 p.i.均給予腹腔注射PTX增強免疫2次（500 ng/只）。HQGP組在d3 p.i.開始腹腔注射HQGP ［1 mg/（kg·d）］，持續給藥15 d。

1.2.2 狀態觀察與評分：每天由2人對各組小鼠的一般狀態進行觀察，并對運動功能進行評分，觀察內容包括飲水、攝食、毛發色澤、體質量、運動功能、發病情況等，記錄測量結果。運動功能評分標準采用國際通用的5分法［6］，計算平均起病時間（組內每只動物首發癥狀天數的均值）和平均高峰評分（組內每只動物最高評分的均值）。

1.2.3 腦組織含水量的測定：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，快速斷頭，在冰盒中完整剝離腦組織并稱質量（腦組織濕質量），再將腦組織放入52 ℃電熱恒溫箱烘烤72 h，再稱質量（腦組織干質量）。計算腦組織含水量=（腦組織濕質量-腦組織干質量）/腦組織濕質量。

1.2.4 BBB通透性的檢測：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，末次給藥1 h后，尾靜脈注射2%伊文思藍（evans blue，EB）100 μL/只。以小鼠的眼結膜、四肢、全身皮膚出現明顯藍染為注射成功，100 g/L水合氯醛麻醉后行生理鹽水灌流，冰盒中迅速剝離腦組織，稱質量并記錄腦組織濕質量。然后加甲酰胺溶液浸泡，45 ℃避光孵育72 h，充分勻漿后，15 000 r/min離心20 min。在酶標儀上630 nm處測定上清液吸光度值（A）。根據EB標準曲線求出 EB含量，用EB濃度（μg·mL-1）/腦濕質量（μg·g-1）表示。

1.2.5 病理標本采集及處理：免疫后第18天，每組各取5只小鼠，100 g/L水合氯醛麻醉后行4%多聚甲醛灌流，分離脊髓組織，用冰凍切片包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）包埋，置液氮蒸汽中凝固后，迅速放入-80 ℃冰箱凍存。制作冰凍切片，厚度10 μm，然后行免疫熒光染色。

1.2.5.1 HE染色 于水中浸泡脊髓冰凍切片2 min，蘇木精染色10 min，水洗1 min，5%鹽酸乙醇分化15 s，伊紅染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封片后，顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況。

1.2.5.2 LFB髓鞘染色 95%乙醇浸泡取脊髓冰凍切片3 min，固藍液中57 ℃孵育24 h，去離子水浸洗3 min，95%乙醇浸洗3 min，0.05%碳酸鋰溶液浸泡15 s，70%乙醇分化至灰白質清晰可辨，去離子水迅速沖洗3 min，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察髓鞘脫失情況。使用Image Pro Plus軟件計算小鼠髓鞘脫失面積與白質面積比值。

1.2.6 免疫熒光染色：取脊髓冰凍切片，室溫晾干，PBS洗5 min×3次，10 g/L BSA-PBS室溫封閉1.5 h后，分別加入1 ∶1 000稀釋的兔抗小鼠CD4和CD68抗體，4 ℃過夜；次日于室溫下再用PBS洗5 min×3次，濾紙吸干，加入Alexa Fluor 555 標記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育2 h，PBS洗5 min×3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。使用Image Pro Plus軟件統計每個完整切面的炎癥細胞數量，比較2組每個完整切面CD4+和CD68+細胞數，分析炎癥細胞浸潤情況。

1.2.7 Western blotting檢測緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達：脊髓組織提取蛋白定量后，加入5×上樣Buffer，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入1 ∶1 000稀釋的兔抗小鼠Occludin、ZO-1和GADPH一抗，4 ℃過夜；次日TBST洗滌后，加入1 ∶5 000稀釋的HRP標記的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗滌后進行化學發光反應，用Bio-RAD凝膠成像儀分析條帶，用Band Scan分析2組Occludin和ZO-1的灰度值與內參GAPDH的灰度值比值，并進行統計學分析。

1.3 統計學分析

采用統計分析軟件GraphPad Prism 5.0進行統計分析處理，2組間實驗數據的比較采用Student-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HQGP對EAE小鼠癥狀和病變的影響

與前期研究［7］結果一致，與EAE模型組比較，HQGP治療可減輕EAE癥狀，延緩發病。病理結果顯示，HQGP治療可顯著降低炎癥細胞向脊髓組織浸潤，降低髓鞘脫失面積。

2.2 腦組織含水量及BBB通透性檢測結果

免疫后18 d，HQGP組小鼠腦內水、EB含量均低于EAE組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1和表1。

圖1 EAE和HQGP組小鼠腦組織水和EB含量比較Fig.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups

表1 2組小鼠腦組織含水量和EB含量比較（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

表1 2組小鼠腦組織含水量和EB含量比較（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs EAE group.

2.3 2組小鼠脊髓炎癥細胞浸潤情況

2組脊髓腰骶段橫斷面冰凍切片免疫熒光染色顯示，CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞主要在脊髓白質區表達，且EAE組CD4+T細胞數（114.3±11.84）高于HQGP組（46.0±6.72），差異有統計學意義（P＜0.001），提示HQGP能明顯減輕CD4+T細胞向脊髓的浸潤；EAE組CD68+巨噬細胞數（102.70±12.26）顯著高于HQGP組（35.33±13.08），差異有統計學意義（P＜0.001），提示HQGP能明顯減少CD68+巨噬細胞浸潤數量。見圖2。

2.4 2組小鼠緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達情況

圖2 2組小鼠脊髓CD4+和CD68+細胞浸潤情況比較Fig.2 Comparison of CD4+ and CD68+ cell infiltration in spinal cords of EAE and HQGP groups

Western blotting結果顯示，HQGP組小鼠脊髓內細胞緊密連接蛋白Occludin表達水平（2.01±0.14）較EAE組（0.94±0.07）增高，HQGP組小鼠脊髓內細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達水平（2.37±0.20）較EAE組（0.964±0.14）增加，差異均有統計學意義（均P＜0.001）。見圖3。

圖3 2組小鼠脊髓內Occludin和ZO-1蛋白表達水平比較Fig.3 Comparison of Occludin and ZO-1 protein expression in spinal cords of EAE and HQGP groups

3 討論

MS及其EAE動物模型廣泛用于涉及T細胞介導的炎癥性疾病的研究，其特征為淋巴細胞浸潤、脫髓鞘和軸突損傷［8］。BBB功能障礙是EAE和MS進展的主要特征之一，炎性細胞因子通過受損的BBB遷移至大腦，導致腦水腫、脫髓鞘和神經細胞死亡［9］。傳統中醫藥可用于治療復雜多變的MS，不良反應少［10］。HQGP是一種從黃芪中提取的有效成分，對MS/EAE中的神經保護和免疫調節有積極作用［11］。本研究探討了HQGP對EAE小鼠癱瘓癥狀的潛在保護作用，結果表明HQGP延遲了EAE的發作，改善了EAE的嚴重程度，且HQGP對EAE的治療作用至少有一部分是通過強化BBB完整性及抗炎作用介導的。

在EAE的復雜過程中，涉及免疫系統的各種細胞，包 括CD4+Th1和Th17，γδT細 胞，CD8+T細 胞，Treg細胞和巨噬細胞［12］。CNS的炎癥浸潤主要是由活化的T細胞和巨噬細胞組成［13］。這也說明MS病程中BBB破壞，從而使循環血液中炎癥細胞穿過BBB浸潤至CNS。免疫熒光標記表明，HQGP處理后，浸潤的CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞數顯著減少。證明HQGP可抑制免疫細胞向脊髓的浸潤，從而有助于改善脊髓的炎癥微環境，從而提高EAE臨床評分。

EB染料廣泛用于檢測BBB滲漏，因為它與血清白蛋白結合形成大分子復合物，在正常生理環境下不能穿過完整的BBB。因此，本研究將EB染料進入大腦的量作為BBB滲透性的指標。結果表明，與EAE小鼠相比，HQGP處理顯著降低了腦中EB的含量。說明HQGP能防止EAE小鼠模型BBB的破壞。

內皮細胞間緊密連接（tight junction，TJ）由大的多蛋白復合物組成，是構成BBB的主要成分之一，緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白Occludin、claudins和胞質蛋白ZO-1組成。Occludin的作用是連接跨膜蛋白和細胞骨架，影響肌動蛋白的收縮性，影響TJ的功能，從而使BBB的通透性明顯低于其他屏障性結構［14］。有研究［15］認為Occludin表達水平可以表明BBB的結構功能狀態，其下降程度可以作為BBB損傷程度的標志。而ZO-1是與TJ相關的主要細胞質蛋白。其作用是將Occludin和claudins的COOH末端連接到潛在的肌動蛋白細胞骨架，據文獻［16］報道，ZO-1或Occludin表達的減少能導致BBB通透性增加。本研究結果顯示，HQGP治療可使EAE小鼠脊髓組織內Occludin和ZO-1的表達增加，表明HQGP能有效地防止EAE模型小鼠中BBB的破壞，促進BBB功能的修復。

總之，本研究表明HQGP可以抑制EAE小鼠CNS炎癥細胞浸潤，改善脫髓鞘程度，促進BBB損傷修復，具體機制可能與上調緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達，抑制炎癥細胞向CNS遷移有關。