脂肪干細胞-絲素/殼聚糖支架復合物在外泌體誘導下的體外成骨效應

魏松喬，郭澍，佟爽，朱夢茹，張華，陳義慶，崔夢瑩

（中國科大學附屬第一醫院整形外科，沈陽 110001）

骨再生是細胞、血管基質和生長因子共同作用的復雜結果［1］。近年來，骨組織工程及再生醫學的興起使生物材料及細胞水平的治療成為骨再生領域中2個主要研究方向［2］。骨組織工程是由合適的種子細胞、可降解的支架材料以及生長因子3個因素構成［3］，用于骨組織工程的種子細胞應具有多向分化潛能且傳代性質穩定［4］，人工骨支架的結構和力學性能須優良［5］。除此之外，影響細胞間信號傳遞的因子對骨再生也有著至關重要的影響［3］。因此，在種子細胞與支架良好結合的前提下，加入既可以促進種子細胞成骨分化又可以通過提高細胞間信號傳遞從而增強細胞間相互作用的生長因子的治療手段，將是一個潛在的新型治療骨缺損的方法。

研究表明，ADSCs在體外誘導條件下具有向骨細胞、軟骨細胞等多向分化的潛能。絲素/殼聚糖復合支架（silk fibroin-chitosan scaffold，SF/CS）具有較低的炎癥毒性、良好的生物降解性及骨傳導耦合性［6］。外泌體是直徑介于30～100 nm、起源于細胞內吞作用的小囊泡，大部分細胞在生理和病理狀態下均可分泌［7］，其內含有多種母細胞來源的生物活性物質［8］，通過這些信息物質可以完成細胞間的信號傳遞［9］。外泌體中包含的核酸類物質進入胞質后可以被翻譯成蛋白質，而通過在細胞間傳遞蛋白和RNA，外泌體可以調節靶細胞及器官的功能和活性［10］，可直接引導間充質干細胞分化進入成骨細胞系。所以，間充質干細胞來源的外泌體可以被用作引導幼稚干細胞向成骨細胞系分化的生物工具［11］。

本研究通過將外泌體與脂肪干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）-SF/CS復合物共培養，探究三維條件下人ADSCs在成骨分化的過程中外泌體對其的作用，并通過探究ADSCs-SF/CS-外泌體復合模式在骨組織再生中的應用潛能，為后續修復骨缺損的骨組織工程研究提供細胞、生物支架材料和生長因子3個方面的資料。

1 材料與方法

1.1 研究對象與材料

脂肪由接受腹部抽脂術的5名25～30歲的健康女性志愿者提供，志愿者對本研究相關內容知情并簽署知情同意書。本研究相關內容和方法均經中國醫科大學附屬第一醫院倫理部門審核并批準，實驗設計方案和倫理問題等均符合要求。

主要試劑：胰蛋白酶、成骨誘導液、普通液態培養基（購自美國 Hyclone公司），青鏈霉素、抗真菌劑、胎牛血清（購自美國Gibco公司），蠶絲、氯化鈣、醋酸、CCK-8試劑、Triton X-100（購自美國Sigma公司），BCA蛋白濃度試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（購自中國碧云天生物技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的培養及體外分化：抽脂共獲得腹部皮下液狀脂肪300 mL，清洗除去大塊纖維組織后，經膠原酶消化及反復離心棄脂肪組織及上清，底部沉淀重懸后均勻接種至培養瓶，置于37 ℃、5% CO2恒定孵箱內，每3 d換液，待細胞達80%融合后用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以1∶3的比例進行傳代。取長勢良好的第3代ADSCs以1×105/孔的濃度接種于6孔板后普通培養基培養，待細胞達接觸抑制3～5 d棄培養基，分別加入成脂、成骨及成軟骨誘導液，每3 d換液，直至21 d，4%多聚甲醛固定漂洗后，分別用油紅O、茜素紅及甲苯胺藍染色鏡檢。

1.2.2 外泌體的提取及鑒定：取長勢良好的第3代ADSCs，普通培養液培養至100%融合后加入成骨誘導液（無外泌體血清、地塞米松磷酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鉀）培養，收集誘導21 d的細胞上清共180 mL，以4 000g離心30 min，棄沉淀留上清；20 000g離心60 min，棄底留上清；100 000g離心1 h棄上清，加入PBS重懸后，再次以100 000g離心1 h，棄上清后可見沉淀，即為較純濃度外泌體。透射電鏡觀察外泌體形態：超速離心提取沉淀以100 μL PBS重懸后，取20 μL加入4%多聚甲醛固定，磷酸鎢染色后透射電鏡下觀察拍照。外泌體蛋白定量檢測：按照BCA蛋白濃度試劑盒要求操作，求得外泌體實際濃度并應用Western blotting檢測成骨誘導的細胞及所提取外泌體中CD9和CD63標記蛋白，采用ECL顯影。

1.2.3 ADSCs-SF/CS復合物的制備：蠶絲脫膠處理后，經透析、過濾、濃縮制得純SF蛋白溶液。將CS溶液以質量比5∶5加入SF蛋白溶液中，充分攪拌制得混合溶液，再次透析后加入24孔板，真空冷凍干燥機凍干24 h后漂洗，并再次凍干48 h即可制成。將乙醇浸泡及紫外燈照射滅菌處理的SF/CS浸于細胞培養液24 h后，將長勢良好的第3代ADSCs以1×105/mL的密度均勻接種于支架上（1 mL/個）。支架內部結構觀察：SF/CS經處理后在掃描電鏡下觀察支架材料內部結構和表面形態并拍照。細胞貼附情況觀察：細胞接種后分別在培養的不同時間點取出樣品，經處理后掃描電鏡下觀察細胞形態及細胞與支架的貼附情況。

1.2.4 實驗分組：將ADSCs-SF/CS復合物分為實驗組a（ADSCs-SF/CS+普通培養液+外泌體組）、實驗組b（ADSCs-SF/CS+成骨誘導液+外泌體組）、陽性對照組（ADSCs-SF/CS+成骨誘導液組）和陰性對照組（ADSCs-SF/CS+普通誘導液組），分別進行培養，每3 d換液，連續培養14 d。

1.2.5 驗證外泌體對ADSCs-SF/CS復合物的成骨效應：加入外泌體共培養后，分別于培養的第1、3、7天取出實驗組a及陰性對照組樣本，將細胞洗脫下來制成細胞懸液，加入CCK-8試劑，測定ADSCs的增殖情況。培養14 d后，將各組樣本支架上的細胞消化下來并裂解，應用Western blotting驗證成骨相關蛋白Runx2的表達，并按ALP試劑盒說明將樣本與工作液混合，酶標儀測定405 nm處的吸光度，從而得出各組樣本ALP活性變化。

1.3 統計學分析

Western blotting條帶結果應用Image J圖像分析軟件灰度掃描后，以β-actin為內參進行半定量分析。各組數據均用表示，采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 24.0軟件進行統計學分析，ALP活性檢測結果采用獨立樣本t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs的生長特性及體外誘導結果

倒置顯微鏡下可見剛傳代的脂肪細胞呈圓形或橢圓形懸浮于培養液中，24 h可全部貼壁，初期細胞體積較小，呈紡錘形或梭形；72 h細胞體積逐漸增大，呈梭形；120 h梭形細胞大量增殖，局部呈平行或漩渦狀緊密排列（圖1）。分別用油紅O、茜素紅及甲苯胺藍染色，鏡下所見證實ADSCs具有向成熟的脂肪細胞、骨細胞及軟骨細胞多向分化的潛能（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下可見原代培養5 d后ADSCs增長活躍 ×100Fig.1 Image under an inverted microscope：adipocyte growth was active after primary culturing for 5 days ×100

圖2 ADSCs向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞誘導分化21 d ×100Fig.2 ADSCs were induced to differentiate into adipocytes，osteoblasts，and chondrocytes after being fostered for 21 d ×100

2.2 外泌體的形態及鑒定

透射電鏡下可見外泌體直徑介于40～100 nm之間，為具有明顯雙層膜結構的圓形杯盤狀囊泡（圖3）。應用BCA蛋白濃度試劑盒測得平均每180 mL上清可提取外泌體蛋白濃度約為1.340 μg/μL。Western blotting法以β-actin內參為標準，可見成骨誘導21 d的ADSCs及提取的外泌體中均有CD9和CD63標記蛋白表達，進一步證實提取的外泌體來源于成骨分化的ADSCs（圖4）。

2.3 ADSCs-SF/CS復合物在外泌體誘導下的成骨效應

2.3.1 掃描電鏡下觀察細胞在支架內附著情況：電鏡下可見SF/CS材料呈多孔網狀結構，孔隙的走向沒有方向性。孔徑大小從數十到300 μm不等，孔與孔之間相連通，孔隙內壁平滑平整（圖5），培養1周時支架表面及孔隙中可見ADSCs黏附，細胞與支架材料緊密黏接，偽足向各個方向伸展，細胞周圍可見細胞外基質（圖6）。

圖3 外泌體透射電鏡圖 ×80 000Fig.3 Exosomes observed under a transmission electron microscope ×80 000

圖4 ADSCs及外泌體的Western blotting檢測結果Fig.4 Western blotting results of ADSCs and exosomes

圖5 掃描電鏡下SF/CS呈多孔網狀結構 ×200Fig.5 The SF/CS scaffold appears as a porous network structure under scanning electron microscope ×200

圖6 ADSCs可附著于SF/CS表面并生長 ×1 500Fig.6 Proliferation of ADSCs attached to the surface of the SF/CS scaffold ×1 500

2.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖：CCK-8法結果顯示，與陰性對照組相比，實驗組a的ADSCs在培養的第1、3、7天增殖能力呈明顯的增長趨勢（圖7），表明向培養液中加入外泌體有利于ADSCs的增殖。

2.3.3 成骨相關蛋白Runx2及ALP活性檢測：Western blotting法結果發現，培養14 d時與陽性對照組（0.841 3±0.101 2）相比，實驗組b中成骨相關蛋白Runx2的表達含量（1.587 4±0.090 3）增加（圖8）。此外，與陰性對照組的ALP活性（0.453 7±0.081 3）相比，實驗組a的ALP活性（2.546 2±0.197 6）顯著增高（P＜0.01）；與陽性對照組的ALP活性相比（1.075 7±0.080 6），實驗組b的ALP活性（3.495 5±0.390 5）也明顯增高（P＜0.01）。表明外泌體不僅可以誘導ADSCs成骨，其對ADSCs的成骨還具有促進作用。

圖7 CCK-8法測量細胞增殖活性Fig.7 Cell proliferation activity as measured by CCK-8

圖8 成骨相關蛋白Runx2的Western blotting檢測結果Fig.8 Western blotting results of Runx2

3 討論

本研究結果顯示，ADSCs不僅具有多向分化的潛能，而且增殖能力強、生物學特性穩定，所以憑借其來源豐富、獲取安全便捷、對供區損傷小等優勢，ADSCs可以作為種子細胞為骨組織修復提供充足的時間及原材料。本課題組前期研究［12-13］結果表明，將SF與CS以質量比5∶5的比例共混可制備出功能更加完善的復合支架，不僅結構更穩定，多種良好的生物學性能也得以保持。本研究通過掃描電鏡觀察發現，人ADSCs與SF/CS復合后，材料的多孔結構使細胞易于長入，其平整的表面和適當的孔徑可以使細胞在材料表面和孔隙中增殖、分泌細胞外基質，在相對穩定的培養條件下，細胞可以在支架上正常的伸展、黏附和生長，這說明SF/CS對人ADSCs有良好的親和性和生物相容性。

此外，本課題組前期研究將提取的外泌體按體積比稀釋，形成不同的濃度梯度，并在二維條件下與人ADSCs共培養，以觀察其對人ADSCs增殖、礦化的影響。結果證實，濃度為15 μg/μL的外泌體促進ADSCs增殖、礦化的效果最強，且隨著培養時間的延長，細胞的增殖越明顯。因此，本研究先將ADSCs種植于SF/CS，以前期研究結果為準，在實驗組中加入等量（50 μL）濃度為15 μg/μL的外泌體，在三維環境中觀察外泌體對ADSCs成骨分化作用的影響。通過CCK-8法檢測細胞的增殖，并驗證成骨相關蛋白Runx2及ALP的活性變化。本研究結果顯示，外泌體可以在體外環境下誘導負載于SF/CS上的人ADSCs向成骨細胞分化，并且對人ADSCs向成骨細胞分化具有促進作用。

雖然ADSCs的成骨能力在骨組織工程中具有重要的應用潛能，但仍有一些問題尚未解決，如ADSCs成骨分化現象的內在分子機制仍需進一步的研究。而且目前關于誘導ADSCs成骨的研究大多是體外及動物實驗，缺少體內研究，要想將ADSCs作為種子細胞應用于臨床骨組織再生，仍需大量的實驗和臨床前研究。此外，本研究制備的復合支架雖基本符合目前骨組織工程的生物材料要求，種植細胞的結果也表明SF/CS對ADSCs無明顯毒性和不良反應，但其細胞和組織相容性以及在體內的降解情況等仍有待進一步研究。最后，外泌體雖然在骨組織修復領域有著良好的應用前景，但同時也存在諸多阻礙其發展的因素，最主要的挑戰就是如何實現大量生產。目前常用的提取方法只能提供少量純度低的外泌體，比如5×106個骨髓瘤細胞中只能提取5～6 μg外泌體［14］，且目前常用的2種分離方法——反復超速離心法和反復超濾法的弊端均是時間消耗大。此外，盡管許多研究表明外泌體可以刺激骨生成和血管再生，但確切機制仍然模糊不清。因此，以后的研究必須首先探索出分離和提取外泌體的可靠方法。其次，需要更好的了解外泌體在調節ADSCs成骨和血管生成方面的作用。最后，本研究通過向培養基中加入外泌體的方法來添加促進ADSCs成骨的誘導因素，而后期如何制備具有緩釋外泌體效應的支架以用于動物實驗，以及最終制備出可以用于人體的外泌體-ADSCs-SF/CS復合模式，還有待進一步研究。