ALDH3B1在急性淋巴細胞白血病中的表達及意義

劉雨薇，曲藝，顏曉菁

（中國醫科大學附屬第一醫院血液科，沈陽 110001）

成人急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病［1］。臨床上超過50%的成人ALL患者化療后不緩解或者緩解后復發，且一旦復發再次完全緩解率低，患者總體預后不良［2］。目前，其分子機制尚未完全明確。亟需對ALL發病機制進行深入研究，以尋找新的分子標志物和潛在治療靶點。

乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）家族是一類依賴NAD（P）+來催化內源性和外源性的醛氧化成為相應羧基酸的酶。在人體中發現該蛋白質超家族由19個成員組成［3］，定位在不同的染色體上。ALDH基因家族廣泛參與體內各種脂類的代謝，可以降解細胞內有毒物質，對細胞有保護作用［4-6］。同時，ALDH基因家族還被證實與惡性疾病的發生密切相關［7-12］。

ALDH3B1是ALDH的家族成員，其編碼基因位于11q13.2，編碼蛋白長度為52×103［9-11］。目前ALDH3B1的研究相對較少，其功能尚不清楚，與細胞內活性氧的清除及維甲酸代謝相關［12-14］。本研究擬明確ALDH3B1基因在ALL患者中的表達情況，并對其臨床意義進行分析，進而初步探索其在ALL細胞系中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象和臨床數據采集

納入2012年1月至 2016年2月在中國醫科大學附屬第一醫院血液科初診的43例ALL患者（ALL組），經過骨髓細胞形態學及免疫分型等檢查確診為ALL，均為 L2 型。其中T淋巴細胞白血病（T-ALL）5例，B淋巴細胞白血病（B-ALL）38例，男∶女=23∶20，平均年齡 40.1（16～67）歲。收集患者的臨床信息。實驗室檢查包括初診時骨髓中原始細胞數、外周血白細胞數、中性粒細胞數、血紅蛋白含量、血小板數、染色體核型分析、融合基因檢測結果、二代測序結果。臨床治療情況包括是否達到完全緩解、治療方案（包括造血干細胞移植）、復發情況、生存時間等。選擇同期20例非造血系統惡性疾病患者作為對照組，男∶女=5∶15，平均年齡 50.8（16～73）歲。分離患者骨髓單個核細胞，提取RNA進行檢測。用于研究的骨髓細胞均來自臨床檢驗的剩余標本，且均獲得了患者的知情同意。

1.2 主要試劑

高效 cDNA逆轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司。人ALL細胞系Jurkat、Molt-4購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，骨架質粒、Transfect慢病毒包裝試劑、聚凝胺購自中國和元生物技術（上海）有限公司。嘌呤霉素購自美國Solarbio公司，纖連蛋白購自美國EMD Milipore公司，CCK-8購自日本同仁。抗體：ALDH3B1購自美國Thermo公司，GAPDH和二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜、ECL檢測發光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA逆轉錄：采用TRIzol Reagent法提取總 RNA。根據測定濃度將RNA均稀釋至200 ng/μL，根據試劑盒逆轉錄反應合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3.2 實時定量PCR：ALDH3B1引物，上游序列5’-C ATCCTGCCCATCGTGAA-3’，下游序列5’-GTGCATG AAGCCGTCGTT-3’，產物長度為169 bp。GAPDH引物，上 游 序 列5’-TTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游序列5’-CTGTGGTCATGAGTCCTT-3’，產物長度為142 bp。按照 SYBR Premix Ex Taq 的說明配制定量 PCR 反應體系。PCR反應：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40 個循環。反應結束后，從程序中讀取Ct值。計算2-△△Ct進行相對定量，△Ct=CtALDH3B1-CtGAPDH。

1.3.3 細胞培養：ALL細胞系Jurkat、Molt-4、BALL-1培養于含10%胎牛血清的 1640培養液。293T細胞系培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液。培養條件：37 ℃、5% CO2培養，根據細胞密度進行傳代。

1.3.4 ALDH3B1病毒的制備：空載質粒H149 pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag，過表達質粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-ALDH3B1-3Flag，293T細胞轉染前1 h換用Opti-MEM培養基，將制備好的包裝試劑和質粒復合物（骨架質粒∶穿梭質粒=1∶1）加入培養基靜置20 min后加入細胞培養基中，37 ℃孵育6～8 h后吸去培養基，PBS洗滌后加入新鮮培養基。轉染后48和72 h收集上清，上清液3 500 r/min離心10 min，棄掉沉淀后用0.22 μm濾膜過濾，30 000 r/min、4 ℃離心2 h，棄上清，用100～200 μL培養預冷的 DPBS重懸，4 ℃過夜，分裝后測滴度。

1.3.5ALDH3B1穩定過表達細胞系的建立：Jurkat細胞系以1×105/mL的密度按照最適感染復數MOI加入病毒，加入聚凝胺（終濃度為5 μg/mL）轉染，轉染后細胞培養72～96 h后用嘌呤霉素（最適濃度為3 μg/mL）篩選穩定株。培養1個月后用實時定量PCR和Western blotting法驗證穩定細胞系中ALDH3B1的表達情況。

1.3.6 細胞增殖實驗：以1×105/mL的密度接種細胞至96孔板，于0、24、48、72 h每孔加入CCK-8試劑 10 μL，孵育90 min后測450 nm吸光度（optical density，OD），OD值與活細胞數成正比。

1.4 統計學分析

按照ALDH3B1表達量從高到低排序，以總例數的75%為界分為高表達組和低表達組，實驗結果采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析和非配對t檢驗比較各組間的差異，采用生存曲線比較生存時間。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH3B1基因的表達情況和臨床數據分析

檢測初發ALL組45例患者和對照組20例非造血系統惡性疾病患者骨髓單個核細胞中ALDH3B1基因的表達水平，結果顯示，初發ALL組患者中ALDH3B1的表達水平明顯低于對照組（P=0.000 6），見圖1。

進一步分析ALL患者中ALDH3B1的表達水平與臨床特征的相關性。以患者初診時白細胞數＞30×109/L（B-ALL）或＞100×109/L（T-ALL）為高白細胞血癥，結果顯示，高白細胞血癥患者ALDH3B1基因的表達水平低于非高白細胞血癥患者（P=0.035 8）。20例ALL患者在我院治療并且獲得隨訪信息，其中16例緩解后復發，復發患者ALDH3B1基因的表達水平較未復發患者降低（P=0.046 2）。見表1。

圖1 2組患者ALDH3B1的表達Fig.1 ALDH3B1 expression in the two groups

表1 ALL患者的臨床特征與ALDH3B1基因表達的相關性Tab.1 Correlation between the clinical characteristics of patients with acute lymphoblastic leukemia and the expression of ALDH3B1 gene

急性白血病患者初始時白細胞數量增高以及疾病復發是預后不良的指標，本研究分析了ALDH3B1基因表達水平和患者生存情況的關系，以總例數的75%作為分界，將患者分為高表達組和低表達組，生存時間按照隨訪時生存天數計算。結果發現，ALDH3B1低表達患者生存時間明顯低于高表達患者（P=0.034 1，圖2），提示ALDH3B1低表達是一個預后不良的標志。

2.2 ALDH3B1基因在ALL發病中的初步功能學研究

圖2 ALDH3B1表達水平與總生存時間的關系Fig.2 Relationship between ALDH3B1 expression and overall survival time

本研究首先檢測了不同ALL細胞系中ALDH3B1基因的表達情況（圖3），結果發現T-ALL細胞系Jurkat和Molt-4以及B-ALL細胞系BALL-1中ALDH3B1基因表達水平均較對照組降低（P＜0.05）。且T-ALL細胞系ALDH3B1基因表達水平較B-ALL細胞系更低（P＜0.05）。

圖3 ALL細胞系中ALDH3B1的表達水平Fig.3 ALDH3B1 expression levels in acute lymphoblastic leukemia cell lines

然后本研究構建了ALDH3B1過表達質粒并包裝了過表達病毒，建立了ALDH3B1穩定過表達的Jurkat細胞系，采用實時定量PCR和Western blotting檢測ALDH3B1的表達情況，結果發現，過表達細胞系ALDH3B1的表達水平較空載對照組明顯增加（圖4）。隨后，本研究用建立的穩定細胞系進行了初步的功能性研究，采用CCK-8方法檢測細胞的增殖情況，結果顯示，過表達組細胞增殖在48和72 h均明顯低于空載對照組和空白對照組（均P＜0.05，圖5）。

圖4 在Jurkat細胞中驗證ALDH3B1過表達Fig.4 Verification of ALDH3B1 overexpression in Jurkat cells

圖5 過表達ALDH3B1對Jurkat細胞增殖的影響Fig.5 Effect of ALDH3B1 overexpression on the proliferation of Jurkat cells

3 討論

ALL發病年齡呈雙峰，集中在兒童期和50歲左右。ALL兒童常規化療效果明顯好于成人，5年總生存率約為90%。ALL成人患者總體療效相對較差，近年來隨著兒童化療方案在成人中的應用，靶向治療和移植技術的進展，成人ALL的預后已經得到改善，患者完全緩解率較高，但仍有相當多的患者出現復發和耐藥，5年生存率僅為30%～40%［2］。因此，需要進一步研究ALL發生、發展的分子機制，為診治和判定預后提供新的分子標志。

ALL是一種起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，但其發病機制尚不明確。代謝異常現在被認為是癌癥的特征之一，腫瘤代謝譜檢測或者某些調節代謝的基因可以用于腫瘤患者的診斷、療效評估和預后判定，亦可用于癌癥的治療，針對信號轉導途徑或酶機制設計靶向治療藥物［1］。前期研究發現，一種編碼醛脫氫酶超家族成員之一的基因ALDH3B1在ALL中表達減低，且與患者初診時白細胞數量增高有關，目前認為成人ALL的不良預后與患者診斷時白細胞數高、混合系白血病基因陽性［如t（4；11）］、Ph染色體陽性、亞二倍體等［1］有關。與此一致，本研究結果顯示ALDH3B1低表達的患者復發率更高，長期生存時間更短，提示ALDH3B1低表達可以作為一個有效的預后判定分子標志。但因病例數較少，ALDH3B1表達水平與ALL患者染色體異常以及基因突變之間的關系本研究并未分析，需要進一步擴大樣本加以研究。本研究結果也提示，ALDH3B1可能作為抑癌基因參與了白血病的發生發展。

ALDH超家族蛋白廣泛參與體內各種脂類、氨基酸和抗體的代謝，參與內、外源性醛與其相應酸的不可逆氧化反應。ALDH基因家族還被證實與惡性疾病的發生密切相關，如ALDH2與再生障礙性貧血、白血病的進展相關［7］。但ALDH3B1與腫瘤的關系目前尚不清楚。本研究通過初步的功能學研究發現，過表達ALDH31確實可以抑制白血病細胞的增殖，其分子機制有待于進一步研究。有研究［14］表明，ALDH3B1與活性氧代謝相關，活性氧在生物體中不斷產生，無法處理活性氧負擔會增加氧化應激，從而導致蛋白質和DNA的改變，細胞磷脂的脂質過氧化，能產生超過200種反應性醛，而ALDH可以通過代謝多種醛類減弱氧化應激。因此可以推測，ALDH3B1表達增高，可能通過代謝細胞內產生的反應性醛影響白血病細胞的抗氧化應激能力，從而影響細胞的活性，其具體分子機制需要進一步研究。

總之，本研究表明ALDH3B1可能參與了ALL的發病過程，且可以作為一個新的潛在分子標志物用于ALL的診斷和預后判定。