蒼術－玄參藥對對糖尿病小鼠降糖作用有效部位篩選

蔣梅香,劉穎新,陳 容,楊 惠,狄慶鋒,劉利利

(湖南中醫藥高等?？茖W校,湖南 株洲412012)

蒼術－玄參藥對淵源于《施今墨對藥》[1],二者相須為用,具有滋陰清熱、健脾滋腎之功效,該藥對在臨床常用于治療糖尿病[2]。目前對于蒼術－玄參藥對的研究主要集中在提取工藝優化和配比成分分析方面[3],而對于降糖有效部位的篩選目前尚未見報道。本實驗通過對蒼術－玄參藥對不同極性部位的分離,結合糖尿病小鼠模型篩選該藥對降糖作用的有效部位,為深入研究蒼術－玄參藥對降糖作用物質基礎提供參考,同時也為該藥對的后續研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

7100型全自動生化分析儀(日本日立公司)；三諾安準血糖儀(長沙三諾生物傳感技術有限公司)；FA2004B型電子天平(上海精科天美儀器有限公司)；KS-600EI超聲波清洗機(鄭州萬博儀器設備有限公司)；DZF-1型真空干燥箱(北京永光明醫療儀器廠)。

1.2 藥材與試劑

蒼術、玄參購于長沙雙鶴醫藥有限責任公司,經湖南中醫藥高等專科學校彭學著教授鑒定,分別是菊科植物茅蒼術(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)的干燥根莖、玄參科植物玄參(Scrophularia ningpoensisHemsl.)的干燥根。

鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號：ABB9058,規格：0.5 g/片)；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗動物

SPF級ICR雄性小鼠,體重18～22 g,由長沙市天勤生物技術有限公司提供,許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

2 方法

2.1 蒼術－玄參藥對各提取部位的制備

根據前期研究結果,稱取蒼術、玄參藥材飲片共1 500 g(蒼術∶玄參＝2∶1)[4],通過水蒸氣蒸餾提取藥材中揮發油類成分(按《中國藥典》2015版一部附錄方法),1 500 g藥材得到揮發油共18.91 g(得率1.26%)。水提取液中加入乙醇,使含醇量達到70%,靜置24 h,過濾,得濾液和沉淀。沉淀減壓干燥后得多糖部位共424.39 g(得率28.29%)。將干燥后的藥渣用無水乙醇回流提取2次(每次3 h),將提取液與之前的濾液合并、濃縮。采用系統溶劑分離法對濃縮液進行分離,依次加入二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取。分別得到二氯甲烷部位8.85g(得率0.59%)、乙酸乙酯部位20.60 g(得率1.37%)和正丁醇部位63.19g(4.21%)。依次稱取5個提取部位的浸膏,加入適量0.5%CMC-Na溶液混懸,備用。

2.2 動物模型的制備

ICR小鼠80只,適應數天后,隨機分為對照組(10只)和模型組(70只),對照組采用正常飼料喂養。模型組參照文獻[5-6],連續喂養高脂飼料30 d,禁食不禁水12 h后,按照120mg/kg劑量腹腔注射STZ溶液(pH＝4.4的檸檬酸鈉緩沖液配置),小鼠尾靜脈取血測定空腹血糖值(FBG),空腹血糖≥11.1 mmol/L判定為造模成功。

2.3 動物分組及給藥

將造模成功的小鼠隨機分為7組,每組10只,分別為模型組、二甲雙胍組、二氯甲烷組、多糖組、乙酸乙酯組、揮發油組和正丁醇組。各給藥組均按照臨床劑量[7-8]2倍折算成動物給藥劑量[9],即二氯甲烷組為0.04 g/kg、乙酸乙酯組為0.094g/kg、正丁醇組為0.29g/kg、多糖組為1.93 g/kg、揮發油組為0.086 g/kg(按生藥量計算),二甲雙胍組0.25 g/kg。對照組和模型組每天1 g給予0.5%CMC-Na,每日1次,連續4周。

2.4 指標檢測

2.4.1 小鼠基本狀態觀察 觀察記錄小鼠的精神狀態,毛發,飲水,進食等一般狀態,并記錄體質量變化情況等。

2.4.2 空腹血糖的測定實驗 給藥4周后,小鼠尾靜脈取血,采用血糖儀和試紙測定其空腹血糖(FBG)。

2.4.3 指標測定 按照試劑盒要求對總膽固醇(TC),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)進行測定。

2.5 統計分析

通過SPSS22.0軟件對數據進行雙樣本t檢驗及方差分析,實驗數據以(±s)表示。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠基本狀態觀察

喂養4周后,與對照組比較,模型組小鼠飲食、飲水量明顯增加,體重明顯下降,毛發灰暗無光,精神狀態萎靡。二甲雙胍組、多糖組和正丁醇組在體重和一般狀態上有所改善,多飲、多食等癥狀得到明顯好轉。揮發油組、二氯甲烷組和乙酸乙酯組在一般狀態上未出現明顯改善。

3.2 對糖尿病模型小鼠空腹血糖(FBG)的影響

與對照組比較,模型組小鼠的空腹血糖(FBG)水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,陽性藥物組、多糖組、正丁醇組小鼠空腹血糖(FBG)水平顯著下降(P＜0.01,P＜0.05)。結果見表1。

表1 蒼術－玄參藥對各提取部位對糖尿病小鼠空腹血糖的影響 (±s,n＝10)

表1 蒼術－玄參藥對各提取部位對糖尿病小鼠空腹血糖的影響 (±s,n＝10)

注：與對照組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01；與模型組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。下同。

組別 劑量(g·kg-1)空腹血糖(mmol·L-1)給藥前 給藥4周后對照 － 6.39±1.12 6.75±1.38模型 － 19.47±4.96＃＃ 22.53±4.25＃＃二甲雙胍 0.25 19.13±4.32＃＃ 15.64±3.78??揮發油部位 0.086 20.41±5.14＃＃ 22.67±4.21多糖部位 1.93 19.09±3.85＃＃ 17.21±4.89??二氯甲烷部位 0.04 19.96±5.08＃＃ 23.70±4.22乙酸乙酯部位 0.094 20.16±3.73＃＃ 22.89±5.05正丁醇部位 0.29 20.52±5.68＃＃ 19.45±3.56?

3.3 對糖尿病模型小鼠血脂的影響

與對照組比較,模型組小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平有非常顯著的升高(P＜0.01),HDL-C含量則顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,二甲雙胍組、多糖組和正丁醇組小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平均顯著降低(P＜0.05；P＜0.01),HDL-C水平顯著升高(P＜0.05；P＜0.01)；揮發油組小鼠血清中TG水平顯著降低(P＜0.05)；乙酸乙酯組小鼠血清中HDL-C水平顯著升高(P＜0.05)。結果見表2。

表2 蒼術－玄參藥對各提取部位對糖尿病小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s,mmol·L-1)

表2 蒼術－玄參藥對各提取部位對糖尿病小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s,mmol·L-1)

組別 劑量(g·kg-1) TC TG LDL-C HDL-C對照 － 1.56±0.32 0.76±0.18 0.32±0.15 3.18±0.27模型 － 3.19±0.47＃＃ 1.52±0.22＃＃ 0.78±0.20＃＃ 1.72±0.36＃＃二甲雙胍 0.25 2.23±0.15?? 1.03±0.30?? 0.49±0.13? 2.61±0.19??揮發油部位 0.086 2.94±0.52 1.29±0.27? 0.70±0.27 1.81±0.33多糖部位 1.93 2.37±0.29?? 1.21±0.15? 0.52±0.11? 2.55±0.28??二氯甲烷部位 0.04 3.07±0.18 1.50±0.31 0.69±0.29 1.75±0.32乙酸乙酯部位 0.094 3.10±0.43 1.48±0.17 0.72±0.34 2.27±0.20?正丁醇部位 0.29 2.49±0.31? 1.25±0.13? 0.56±0.18? 2.31±0.14?

4 討論

糖尿病是一種以胰島素抵抗、慢性炎癥及胰島B細胞受損為特征的慢性代謝性疾病,主要臨床癥狀為多飲、多尿、多食、消瘦。近年來,糖尿病的發病率逐年增加,目前已成為嚴重危害人類健康的主要疾病之一[10]。糖尿病在臨床治療上目前仍以二甲雙胍、格列本脲為代表的化學藥為主?；瘜W藥雖具有良好的降糖效果,但因其容易導致多種不良反應而不宜長期使用。中醫藥治療糖尿病的歷史源遠流長,中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點,在糖尿病防治及其并發癥的產生方面具有整體調節優勢[11]。

中藥藥對是相對固定的2味中藥的配伍,二藥合理搭配能夠起到增效或減毒的作用。藥對具備中藥配伍的基本特點,是方劑配伍的精華和核心,也是聯系單味藥與中藥復方的紐帶[12]。藥對的化學成分相對簡單,以藥對作為切入點進行研究有助于闡明中藥復方藥效物質基礎和作用機制[13]。蒼術－玄參藥對出自《施今墨對藥》,二者相須為用,在臨床上用于糖尿病的治療。從試驗結果可以看出,高脂高糖喂養結合STZ成功復制了小鼠糖尿病模型。蒼術－玄參藥對的多糖和正丁醇部位能夠顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。在對糖尿病模型小鼠血脂的影響上可以看出,多糖組和正丁醇組能夠顯著降低小鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平,能夠顯著升高HDL-C水平。與模型組比較,多糖組對糖尿病模型小鼠空腹血糖的改善情況要優于正丁醇組。蒼術－玄參藥對的揮發油、乙酸乙酯和二氯甲烷部位對糖尿病小鼠的空腹血糖沒有顯著影響。

綜上所述,蒼術－玄參藥對中的多糖和正丁醇部位是降糖的有效部位。但正丁醇部位主要含有哪些化學成分,降糖有效部位與無效部位之間是否存在著協同增效關系以及有效部位之間的最佳配伍比例仍需要進一步研究。