microRNA在皮膚黑色素瘤血清與毛發中的差異表達

林千里 張文俊 王中志 汪匯 江華

[摘要] 目的 探討皮膚惡性黑色素瘤miRNA的差異表達有望為該腫瘤的診斷和靶向治療提供依據，篩選皮膚惡性黑色素瘤血清和毛發2個部位的7個特異性miRNA表達差異。 方法 收集2016年3月～2017年10月在海軍軍醫大學附屬長征醫院手術局部切除并經常規組織病理學和免疫組織化學檢測證實為惡性皮膚黑色素瘤（CM）的12個病例作為CM組，同期收集非腫瘤疾病的17個皮膚病病例作為對照組。采用qRT-PCR技術檢測兩組患者的血清和毛發中miRNA表達情況。將檢測結果一致的候選miRNA確定為有意義的共同差異表達生物學指標，利用組間差異倍數篩選出差異>2.5倍差異表達的miRNA。 結果 CM組患者血清中7個miRNA有2個上調，5個下調，上調的miRNA包括miR-4487和miR-4706，下調的miRNA包括miR-16、miR-211、miR-4731、miR-509-3p和miR-514a;毛發中有3個上調，4個下調，上調的miRNA包括miR-211、miR-4487和miR-4731;下調的miRNA包括miR-16、miR-4706、miR-509-3p和miR-514a。與對照組比較，CM組miR-4487在血清和毛發中共同上調，但差異無統計學意義（P > 0.05）。與對照組比較，CM組血清和毛發中has-miR-16和has-miR-509-3p表達顯著下調，差異均有統計學意義（P < 0.05），并且一致性較高;與對照組比較，CM組血清和毛發中miR-541a表達雖然顯示共同下調，但差異無統計學意義（P > 0.05）。血清和毛發差異表達2.5倍以上的miRNA為miR-16和miR-514a;單獨毛發差異表達2.5倍以上的miRNA為miR-4706;單獨血清標本4倍以上差異表達為miR-4731;血清標本10倍以上差異表達的miRNA為miR-211和miR-509-3p。 結論 與非腫瘤疾病患者比較，血清和毛發中存在多種miRNA的差異表達，CM患者血清中miR-211和miR-509-3p存在高度顯著差異表達，可以作為該腫瘤的生物學標志物;毛發標本miR-4706的差異表達有可能成為黑色素瘤早期非創傷性檢測的生物學指標。miRNA檢測對CM是可利用的生物學指標，也可能成為今后靶基因治療的手段。

[關鍵詞] 皮膚黑色素瘤;微小RNA;信號轉導通路;差異表達

[中圖分類號] R739.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（b）-0007-06

Differential expression of microRNAs in serum and hairs different position of cutaneous melanoma

LIN Qianli? ?ZHANG Wenjun? ?WANG Zhongzhi? ?WANG Hui? ?JIANG Hua

Department of Plastic Surgery， Shanghai Changzheng Hospital， Navy Military Medical University， Shanghai? ?200003， China

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of microRNAs in cutaneous malignance melanoma in order to provide a basis for the diagnosis and targeted treatment of this malignancy; to screen seven specific microRNAs in serum and hairs of cutaneous malignancy melanoma. Methods From March 2016 to October 2017， 12 cases of cutaneous melanoma （CM）? confirmed by routine histopathology and immunohistochemistry in Shanghai Changzheng Hospital， Navy Military Medical University， were collected as CM group， while 17 cases of non-neoplastic skin diseases were collected as control group. The expression situation of microRNAs in serum and hair of two groups were detected by qRT-PCR. Candidate microRNAs with consistent results were identified as significant common differential expression biological indicators. The differentially expressed microRNAs （> 2.5 times） were screened by the multiple of differences between groups. Results There were 2 up-regulated and 5 down-regulated microRNAs in serum among 7 microRNAs of patients in CM group. The up-regulated microRNAs included miR-4487 and miR-4706， the down-regulated microRNAs included miR-16， miR-211， miR-4731， miR-509-3p and miR-514a. There were 3 up-regulated and 4 down-regulated microRNAs in hairs， the up-regulated microRNAs included miR-211， miR-4487 and miR-4731; the down-regulated microRNAs included miR-16， miR-4706， miR-509-3p and miR-514a. The co-up-regulated microRNAs in serum and hairs of the CM group were microRNAs-4487， but there was no statistically significant difference between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the expressions of has-microRNA-16 and has-microRNA-509-3p were significantly down-regulated， the differences were statistically significant （P < 0.05）， and with high consistency. Compared with control group， the expression of miRNA-541a in serum and hairs of CM group was down-regulated， but there was no statistically significant difference （P > 0.05）. MiRNAs with more than 2.5 times differential expression in serum and hairs were miR-16 and miR-514a. In hair alone， miR-4706 was with differential expression of more than 2.5 times. The miR-4731 was more than 4 times differentially expressed in serum samples alone. MiRNAs with more than 10 times differential expression in serum were miR-211 and miR-509-3p. Conclusion Compared with non-cancer patients， there are many differentially expressed microRNAs in serum and hairs. There are highly significant differentially expressed microRNAs 211 and 509-3p in serum of CM patients， which can be used as biological markers of the tumor. Differential expression of microRNAs 4706 in hair samples may be the biology of early noninvasive detection of melanoma. Indicators. Detection of microRNAs is an available biological indicator for CM， and may become a means of target gene therapy in the future.

[Key words] Cutaneous melanoma; MicroRNA; Signal transduction pathway; Differential expression

惡性黑色素瘤是最具侵襲性和轉移性的腫瘤，雖然在各種皮膚惡性腫瘤發病中僅占4%，但易轉移，已成為一種嚴重威脅人類健康的癌癥，死亡率高達70%左右[1]，轉移性黑素瘤（CM）患者的5年生存率不足15%[2]。皮膚黑素瘤中存在異常表達的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），而且與該疾病病情演進和轉移等惡性程度的研究報道日益增多[3-5]。miRNA是一類長度為20～24 nt的非編碼單鏈小RNA，約占整個基因組的1%，有研究[6-7]認為人類基因組中約1/3受miRNA調控。miRNA參與了人類大多數腫瘤疾病的發生和發展，其作用類似抑癌基因或癌基因，目前相關研究主要集中于乳腺癌、肺腫瘤、肝癌、前列腺癌和白血病等。本研究運用PCR技術檢測血清和毛發不同部位CM miRNA表達，以便進一步研究CM在早期診斷上的意義以及轉錄后調控水平的發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月～2017年10月在第二軍醫大學附屬長征醫院（以下簡稱“我院”）手術局部切除并經常規組織病理學和免疫組織化學檢測證實為皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignance melanoma，CMM）的12例患者，并設為CM組;選擇同期我院收集17個非腫瘤皮膚病病例作為對照組。12例CM組患者中，男7例，女5例;年齡29～81歲，平均（54.3±13.3）歲。臨床皮損表現為黑斑、結節、腫塊和潰瘍等，分布于肢端7例，腹壁5例。其中1例已發生局部淋巴結內轉移。術后分別經2名及以上病理醫師單獨診斷。所有患者術前均未接受任何治療。17例對照組患者均經病理確診排除黑色素瘤樣病變，其中男12例，女5例;年齡19～73歲，平均（52.5±10.4）歲。兩組病例年齡和性別比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均在術前均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

1.2.1 血液樣本? 采集受試者靜脈全血，置于5 mL血清采集管中，室溫靜置1 h后離心（2700×g，10 min），冰浴上小心吸取上層血清至EP管中，標記后置于-80℃保存備用。

1.2.2 毛發樣本? 留取受試者枕部毛發發梢，每例受試者留取10根，長度為1 cm，用70%乙醇5 mL浸泡1 h，加若干蒸餾水洗凈，加入5 mL 4℃ 0.9%NaCl溶液置粉碎機中充分粉碎10 min，收集后置EP管中，隨后加入5% β-巰基乙醇1 mL和20 μL蛋白酶K（20 mg/μL），置37℃孵育箱10～12 h，再加入2 mL氯仿，經離心（4700×g，3 min），置1.5 mL EP管，標記后置于-80℃保存備用。

1.3 主要試劑

mirVanaTM miRNA提取試劑盒、mirVanaTM miRNA標記試劑盒均購自美國Ambion公司。逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自德國Qiagen公司，Applied Biosystems 7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司。1.5 mL無核酸酶離心管（美國Axygen公司）;磁力攪拌棒、磁力攪拌盤（美國Corning公司）;微型離心器（美國ThermoFisher公司）;染色盤和滑架（×3）（英國ThermoShandon公司）;NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀（美國Thermo公司）。

1.4 方法

1.4.1 提取miRNA? 依照說明書提取血清和毛發組織中的總RNA（富集miRNA）。提取總RNA每個標本用1 mL Trizol試劑對組織進行裂解，將上述裂解液轉入EP管中，室溫下靜置5 min;每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿后振蕩15 s，室溫靜置2～3 min，2～8℃條件下12000×g離心15 min;收集上層水相置于新EP管中，每1 mL Trizol中加0.5 mL異丙醇，室溫下靜置10 min，12000×g離心10 min;棄上清液，每1 mL Trizol加1 mL 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500×g離心5 min，棄上清;讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥。無核酶水中溶解RNA沉淀，采用ND-1000紫外分光光度計檢測波長為260、280和230 nm處所抽提的總RNA中的吸光度（A）值，確定樣品濃度和總量。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4.2 熒光實時定量RT-PCR法測定miRNA? ①逆轉錄合成cDNA：取總RNA 1 μg，miScript逆轉錄酶混合液1 μL，5×miScript RT緩沖液4 μL，加無RNA酶水至反應體積為20 μL。37℃溫浴60 min，95℃ 5 min，終止反應。②熒光實時定量PCR檢測差異表達基因：cDNA進行PCR反應，探針目標序列見表1。cDNA模板2 μL，加無RNA酶水定容至總反應體積50 μL。反應條件：初始活化95℃ 15 min;變性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 34 s，共40個循環。相同條件下實驗重復3次。miRNA測定選取U6 snRNA作為內參;相對表達量用2-ΔΔCt值表達。2-ΔΔCt值以>2.5倍為顯著性差異，即兩組樣本miRNA表達差異倍數>2.5倍。

表1? ?定量PCR探針目標序列

1.5 統計學方法

采用GeneSpringGX基因分析統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清和毛發2種不同來源的miRNA qRT-PCR檢測結果

與對照組比較，CM組患者血清中上調的miRNA為miR-4487和miR-4706，下調的miRNA為miR-16、miR-211、miR-4731、miR-509-3p和miR-514a;CM組患者毛發中上調的miRNA為miR-211、miR-4487和miR-4731，下調的miRNA為miR-16、miR-4706、miR-509-3p和miR-514a;在2種不同類型取材中共同上調的miRNA為miR-4487，共同下調的miRNA為miR-16、miR-509-3p和miR-514a。見表2。

2種不同來源的miRNA RT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，CM組患者血清及毛發中has-miR-4478在血清和毛發中共同上調，但差異無統計學意義（P > 0.05）;兩組miR-4706的表達比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）;CM組血清has- miR-4731表達低于對照組，且差異有統計學意義（P < 0.05），而毛發has- miR-4731表達高于對照組，但差異無統計學意義（P > 0.05）;與對照組比較，CM組血清和毛發中has-miR-16和has-miR-509-3p的表達均下調，但僅血清中has-miR-16差異有統計學意義（P < 0.05）;而CM組血清和毛發中miR-514a表達雖然顯示共同下調，但與對照組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。血清和毛發中has-miR-211的表達相反，CM組血清中miR-211較對照組顯著下調，而毛發中has-miR-211的表達卻較對照組明顯增高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 CM患者血清與毛發組織中miRNA表達譜的差異表達

將12例CM患者血清分別與毛發組織相對應的miRNA表達進行比較，2.5倍以上差異表達miRNA為miR-16（血清中表達降低3.23倍和毛發中表達降低3.12倍）、miR-4706（僅毛發中表達降低3.03倍） 和miR-514a（血清和毛發均存在表達差異性降低，分別降低2.67、2.66倍）;4倍以上差異表達僅為miR-4731（僅血清差異性表達降低8.76倍）;10倍以上差異表達分別為血清miR-211和miR-509-3p（分別降低11.92、12.34倍）。見表3、圖1。

表3? ?CM患者血清和頭發中miRNA檢測結果（ΔΔCt值和2-ΔΔCt值）

注：miRNA 2-ΔΔCt值=2-（ΔCt對照組miRNA檢測值-ΔCt CM組miRNA檢測值），即對照組與CM組miRNA表達差異倍數

以對照組血清和毛發miRNA檢測值為1

圖1? ?黑色素瘤患者血清和頭發中miRNA檢測差異表達倍數（2-ΔΔCt值）

3 討論

miRNA是一種內源性、非編碼蛋白質的短小序列RNA。Zhang等[8]發現miRNA相應的DNA基因拷貝數與轉錄水平的miRNA一致，它可導致miRNA下調。黑素瘤中有85.9%的DNA基因變異相關miRNA表達異常。既往黑色素瘤的研究多基于基因或蛋白水平，近十年來眾多研究表明，表達異常的miRNA與惡性腫瘤的發生和發展密切相關。miRNA調節了人類1/3的編碼基因，因此找出與黑色素瘤發生和增殖相關的關鍵miRNA，并研究這些miRNA與其靶基因的調控關系，可為黑色素瘤早期診斷以及治療的研究奠定基礎[9]。PCR檢測技術因精確精準且價廉，大大加快了其在腫瘤miRNA診斷方面的應用。

目前臨床上缺乏有效的黑色素瘤早期診斷指標。大部分黑色素瘤發現時已為晚期并已發生轉移，因此黑色素瘤的早期診斷有極其重要的意義，而miRNA異常表達的檢測可為黑色素瘤早期診斷提供可能。2012年，Xu等[10]研究發現，與色素痣比較，miR-203和miR-205在黑色素瘤中明顯下調，可作為黑色素瘤早期診斷的生物學標志物。Babapoor等[11]前期研究發現，黑色素瘤組織中miRNA-211顯著低表達。該研究進一步對石蠟包埋黑色素瘤和色素痣組織中進行miR-211原位雜交實驗，結果顯示黑色素瘤中miR-211表達水平明顯低于色素痣，其作為黑色素瘤早期診斷指標的敏感性和特異性分別為90%和86.2%。

本研究運用7條成熟miRNA在人皮膚黑素瘤組織中的表達情況，發現在共同高度差異表達（>4倍）的miRNA為miR-211、miR-509-3p、miR-4731。miR-211在黑色素瘤中的表達水平明顯下調，是該腫瘤的早期輔助診斷指標[12]。本研究中用RT-PCR方法篩選出miRNA與非黑色素瘤患者組織中存在的差異表達，這些差異表達高度下調的miR-211與既往發表的研究結果相同[13-14];同時對于編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BRAF）V600突變陽性和不能手術切除或轉移性的黑素瘤，采用維羅非尼（Vemurafenib）個體化靶向治療，可觀察到miR-211顯著升高[13]。同樣，本次實驗中發現皮膚黑素瘤患者血清miR-509-3p顯著下調（達12.34倍）。有研究發現，磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（Glypicans 6）通過對Wnt、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGFs）和骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）等信號通路導致皮膚黑素瘤生長和轉移，而這一過程可以被miR-509-3p所抑制，反之也說明血清miR-509-3p顯著下調是皮膚黑素瘤進展的重要標志物[14]。但這個實驗結果與丹麥的研究不同，可能與他們所關注的眼結膜黑色素瘤的腫瘤種類不同有關[15]。本研究發現皮膚黑素瘤患者血清miR-4731顯著下調（達8.76倍），Stark等[16]基礎研究證明，miR-4731與細胞周期通路和黑色素瘤發生高度相關，miR-4731過表達可調節細胞周期通路中的CCNA2、ORC5L和PCNA;同時可調節黑色素瘤相關基因RAB7A、CTSD和GNA13的表達，總之，miR-4731表達降低是黑色素瘤的危險因素。

用血清和毛發不同部位黑色素瘤患者標本差異表達miRNA預測到的靶基因參與的信號通路不盡相同，僅miR-16和miR-514a共同低表達于血清和毛發，已有報道，miR-16表達有助于抑制CM腫瘤細胞的增殖[17];目前關于miR-514a對黑色素瘤的作用尚不明確，但有研究報道，miR-514a通過EGFR/MAPK/ERK信號通路，對腎臟腫瘤是一個新的抑制劑[18]。而miR-4706獨特表現于頭發標本，可能與黑色素瘤患者不同部位黑色素形成和功能有關，這也可能是黑色素瘤診斷以及今后設計藥物的靶點。經檢索PubMed、Medline、miRBase22.0、國內萬方和中國知網等數據庫均未發現有miR-4706的相關研究報道，于miRBase22.0數據庫中可以了解miR-4706主要來源于黑色素瘤、成黑素細胞（melanoblast）和視網膜黑色素瘤（uveal melanoma）。差異表達研究中，突出表現在組織來源不同所呈現出相反的結果，如：CM患者血清miR-211和miR-4731檢測結果均表現為顯著下降（ΔΔCt值分別為-3.58和-3.32），而毛發標本檢測結果均為增高（ΔΔCt值分別為0.80和0.82），因此對于miRNA檢測分析中必需加入條件設定，如本研究設定2-ΔΔCt值以>2.5倍為顯著性差異，而對照組均設定為1倍。一般而言，低于2.5倍的DNA或RNA檢測值（2-ΔΔCt值）可被認定為無顯著性差異。在2-ΔΔCt 計算值表達上，與對照組比較，本研究觀察到CM患者血清miR-211顯著降低11.92倍，而毛發部位miR-211表達增高1.70倍;同樣，CM患者血清miR-4731顯著低表達，為8.76倍，而毛發中的表達略增高0.59倍。即miR-211和miR-4731在毛發中的表達基本等同于對照組，可認定為這2個miRNA在毛發中不能靈敏檢測CM病變。

本研究存在的不足之處在于：①收集的標本量不足，容易造成生物信息學分析的遺漏和數據偏移。②本研究中采用的研究方法較簡單，采用倍數分析對基因表達情況進行簡單的統計學推斷方法可比性稍差。③本研究中對研究結果未采用熒光素酶報告基因（Luciferase）和Western blot法的驗證，也未進行體外黑色素瘤細胞株結合體內研究進行驗證。④由于實驗所有的CM標本均來自近2年內的手術患者，患者的預后隨訪以及生存率還無法進行評估。有待進一步深入研究，為黑色素瘤的早期診斷、治療和預后研究提供新的策略。

4 結論與展望

本實驗對12例黑色素瘤和17例非黑色素瘤皮膚病血清和頭發組織miRNA表達水平進行了比較，初步取得了CM有差異性表達的miRNA結果。CM患者血清標本顯示miR-211和miR-509-3p與非腫瘤患者具有10倍以上的差異，是黑色素瘤顯著的生物學標志物;而CM患者毛發標本miR-4706特異性的下調可能是診斷黑色素瘤早期非創傷性檢查生物學標志物。

應用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）技術治療黑色素瘤已成為一種新型治療途徑，有研究者探索將siRNA用于治療，但有效性仍需進一步驗證[19]。由于RNA干擾技術的迅猛發展及臨床實踐的有效性，相信miRNA作為生物標志物極有可能成為未來治療惡性黑色素瘤的治療靶點。未來在增加例數和對各型黑色素瘤分析基礎上，更深入地研究，探討其發病機制及基因治療的思路。miRNA的研究也符合最新美國皮膚病學學會2019黑色素瘤指南的要求，可以為臨床早期輔助診斷、治療以及預后判斷提供更有效的手段[20]。

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（收稿日期：2019-06-05? 本文編輯：任? ?念）