針刺對大鼠酒精戒斷焦慮癥的治療效果及與CRH的關系

邢宇雙 鄭科文 梁啟超 吳宜艷 趙玉佳

[摘要] 目的 觀察并探究針刺治療大鼠酒精戒斷焦慮癥的作用及其機制。 方法 選取SPF級健康雄性SD大鼠54只，采用完全隨機分組方法將其分為空白組、模型（酒精戒斷焦慮癥模型）組、三陰交組、足三里組、電針兩穴（三陰交+足三里）組、針刺兩穴（三陰交+足三里）組，每組9只。除空白組外，其余各組均連續腹腔注射酒精28 d制備酒精成癮模型，撤酒精3 d制備酒精戒斷焦慮癥模型，撤酒精期間分別針刺相應穴位進行治療，針刺3 d。采用高架十字迷宮（EPM）測其焦慮行為，酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測海馬中促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）濃度，實時熒光定量PCR法檢測海馬中CRH mRNA的表達。 結果 與空白組比較，模型組進入開放臂次數比例和停留時間比例明顯減少（P < 0.05），海馬中CRH濃度明顯升高（P < 0.01），CRH mRNA的表達顯著升高（P < 0.01）;與模型組比較，電針兩穴組在EPM中進入開放臂次數比例、停留時間比例明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），針刺兩穴組進入開放臂次數比例增加（P < 0.05），電針兩穴組和針刺兩穴組海馬中CRH濃度明顯降低（P < 0.01），CRH mRNA表達亦顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），而單穴位組對各監測指標的作用效果不明顯（P > 0.05）。結論 針刺能緩解酒精戒斷焦慮癥大鼠的焦慮，其抗焦慮的作用可能與調節大鼠海馬中CRH的表達有關。

[關鍵詞] 針刺;焦慮;酒精戒斷;促腎上腺皮質激素釋放激素

[中圖分類號] R246.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（b）-0012-05

Effect of acupuncture for the treatment of alcohol withdrawal anxiety in rats and its relationship with CRH

XING Yushuang1，2? ?ZHENG Kewen2? ?LIANG Qichao2? ?WU Yiyan2? ?ZHAO Yujia2

1.Graduate School， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar? ?161006， China; 2.School of Pharmacy， Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] Objective To observe and explore the effect and mechanism of acupuncture for the treatment of alcohol withdrawal anxiety in rats. Methods Fifty-four SPF healthy male SD rats were selected and randomly divided into blank group， model （alcohol withdrawal anxiety model） group， sānyīnjiāo group， zúsānlǐ group， electro-acupuncture two-point （sānyīnjiāo + zúsānlǐ） group， acupuncture two-point （sānyīnjiāo + zúsānlǐ） group， with 9 rats in each group. Except the blank group， all the other groups were given continuous intraperitoneal injection of alcohol for 28 days to prepare the alcohol addiction model， withdrawal of alcohol for 3 days to prepare the alcohol withdrawal anxiety model， and they were respectively given acupuncture at corresponding points during withdrawal of alcohol for 3 days. The elevated plus-maze （EPM） test was used to measure the anxiety behavior. The enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure the concentration of corticotropin releasing hormone （CRH） in the hippocampus. The real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of CRH mRNA in hippocampus. Results Compared with the blank group， the percentage of number and residence time of the model group staying in the open arms were significantly reduced （P < 0.05）， the concentration of CRH in the hippocampus was significantly increased （P < 0.01）， the expression of CRH mRNA was significantly increased （P < 0.01）; compared with the model group， the percentage of number of entering the open arm and residence time staying in the open arm during EPM test of the electro-acupuncture two-point group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the percentage of number entering the open arm during EPM test of the acupuncture two-point group was significantly increased （P < 0.05）， CRH concentrations in hippocampus of the electro-acupuncture two-point group and the acupuncture two-point group were significantly decreased （P < 0.01）， and CRH mRNA expression in hippocampus was also significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. However， the effect of single acupoint group on each monitoring index was not significant （P > 0.05）. Conclusion Acupuncture can relieve the anxiety of rats with alcohol withdrawal anxiety， and its anti-anxiety effect may be related to the regulation of CRH expression in the hippocampus of rats.

[Key words] Acupuncture; Anxiety; Alcohol withdrawal; Corticotropin releasing hormone

酒精依賴可導致多種軀體和精神疾病，不僅損害個人健康，更是家庭暴力以及犯罪的重要根源[1]。酒精戒斷綜合征主要表現為不同程度的焦慮癥狀[2]，這種焦慮癥狀是導致復飲的重要風險因素。在焦慮樣癥狀的產生及表達中，常伴隨著促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）-促腎上腺皮質激素（ACTH）-腎上腺內分泌反應軸的功能亢進[3-4]。CRH調節內分泌、自主神經、中樞神經和行為反應，是機體應答應激刺激的重要神經肽[5-6]。研究發現，CRH在介導大鼠酒精焦慮樣癥狀中起著非常重要的作用[7-8]。

針刺作為我國傳統醫學的兩大支柱之一，具有療效穩固、操作安全簡單、無成癮性等優點，自古以來被廣泛用于成癮藥物的脫敏和脫毒治療。研究顯示針刺可緩解焦慮癥狀[9-10]。近年來，一些國內外學者證明了針刺療法對酒精依賴的治療效果[11]，為針刺療法在酒精依賴中的應用提供了強有力的臨床支持。傳統醫學認為，焦慮癥之神志不安多由臟腑功能失調、氣機失常所致，涉及到心、肝、脾、腎。足三里為足陽明胃經合穴，三陰交為足三陰經的交會穴，具有疏肝調肝、健脾化痰、補虛培元的作用，對治療焦慮癥狀具有很好的效果。研究證實，針刺足三里和三陰交穴可調節大腦紋狀體和伏隔核多巴胺神經的興奮性，抑制大鼠過度運動、肌肉僵硬和震顫等酒精戒斷機體癥狀[12]。近幾年張雅紅等[13]在國家自然科學基金項目資助下，完成了電針治療改善酒精依賴住院患者情緒的研究。

綜上所述，本研究欲在動物實驗水平上觀察針刺三陰交、足三里對大鼠酒精戒斷焦慮癥的治療作用，并探究其與CRH之間的關系，為針刺療法防治酒精復飲提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物? SPF級雄性SD大鼠54只，重量220～250 g。哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，質量合格證號：23001700000704。實驗動物飼養在SPF級實驗室，溫度（22.0±2.0）℃，食物和水供應充足。

1.1.2 實驗試劑? CRH酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒：紀寧實業（A04310）;RNA提取試劑盒：美國歐米伽公司Omega（R6731-02）;逆轉錄試劑盒：美國Invitrogen公司（4374967）;SYBR Green熒光染料：美國ORIGENE公司（AGF1380A）;PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 實驗儀器? 針刺針（華佗牌）：廣州得源醫療器械有限公司;電針儀（BT701-1B）：上海華誼醫用儀器有限公司;旋渦混合器（XH-D）：上海比朗儀器有限公司;高架十字迷宮（EPM）：上海欣軟信息科技有限公司;微型離心機（Mini-10K）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;PCR自動系列化分析儀（S1000）：美國Bio-Rad;實時熒光定量PCR：美國應用生物系統公司;RNA濃度分析儀（NanoDrop 2000）：美國Thermo scientific;超凈工作臺（ESCO ACB-4A1）：上海博迅實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精成癮模型的建立及治療? 選取健康SD大鼠54只，體重220～250 g，采用完全隨機分組方法[14]，將其隨機分為空白組（生理鹽水）、模型組（20%酒精）、電針兩穴組（20%酒精+電針單側足三里、三陰交）、針刺兩穴組（20%酒精+針刺單側足三里、三陰交）、三陰交組（20%酒精+針刺單側三陰交）、足三里組（20%酒精+針刺單側足三里），每組9只。除空白組外，其余五組每天腹腔內注射20%（W/V）乙醇1.5 mL/100 g，共28 d，制備酒精成癮模型，撤酒精3 d，制備酒精戒斷焦慮征模型。撤酒精期間分別針刺相應的穴位進行治療，治療前先將大鼠固定在自制的綁鼠臺上，用酒精進行消毒，電針兩穴組進行治療時，針刺單側足三里、三陰交，針柄接上電針儀，選用疏密波，頻率為15～25 Hz，電流為1～2 mA，刺激的強度以大鼠被針刺側的下肢輕微顫抖為度。每天進行1次，每次針刺30 min，連續治療3 d。空白組和模型組在相同的時間內進行與針刺組相同的固定，但不進行針刺治療。

1.2.2 行為學指標測試? 實驗室內光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，保持安靜。將每只大鼠置于高架十字迷宮（EPM）的正中央釋放，測試時間為5 min。每只動物完成測試后，清理糞便，并對裝置用酒精進行徹底清潔消毒。測試指標：進入開放臂次數（OE）：即進入到任一開放臂的次數，以大鼠4個爪均進入到臂內開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，視為該次進入活動完成;進入開放臂時間（OT）：從進入到退出開放臂，在開放臂內停留的時間;進入閉合臂次數（CE）：即進入到任一閉合臂的次數，以大鼠4個爪均進入到臂內開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，視為該次進入活動完成;進入閉合臂時間（CT）：從進入到退出閉合臂，在臂內停留的時間。由以上指標分別計算出：①進入開放臂次數比例（OE%）=OE/（OE+CE）×100%;②開放臂停留時間比例（OT%）=OT/（OT+CT）×100%。

1.2.3 ELISA檢測CRH濃度? 使用前將試劑盒在室溫下平衡30 min。配置標準品稀釋液，濃度分別為480、240、120、60、30 nmol/L。取海馬，稱重，勻漿，離心，取上清，待測。空白孔不加樣，只加顯色劑A、B和終止液用于調零;標準品孔，每孔加入稀釋好的標準品50 μL，零孔加入標準品/樣品稀釋液50 μL，然后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）試劑50 μL;樣品孔，加入樣品50 μL，然后加入HRP試劑50 μL。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養箱中孵育60 min。洗滌5次，拍干。在每個孔內先加入顯色劑A 50 μL，隨后加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩以混勻，37℃下避光顯色，顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光值（OD值）。測定在加入終止液后的10 min內進行。

1.2.4 實時熒光定量PCR法? ①海馬組織中總RNA的提取。用加入β-巰基乙醇的Buffer GTC裂解海馬組織，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，充分混勻。加入蛋白酶K進行裂解，并充分混勻，在55℃水浴鍋中溫育10 min。在室溫下，離心樣品，將上清液加入gDNA柱，離心。在裂解產物中加入50%體積的無水乙醇，混勻。樣品轉入到HiBind RNA Mini Column上，室溫離心，棄去液體。用RNA wash Buffer Ⅰ、RNA wash Buffer Ⅱ洗柱。用65℃水浴鍋預熱的DEPC水洗脫柱子，離心。②逆轉錄為cDNA。10 μL的RNA template（2 μg/μL）、3 μL的RT引物工作液（62.5 nmol/L）混合，離心，然后放入PCR儀中，在65℃下，反應10 min。隨后冰浴2 min。4 μL的RT buffer（5×）、0.5 μL的RNase inhibitor（40 μg/μL）、2 μL的dNTP mix（2.5 mmol/L）、0.5 μL的RT酶（200 μg/μL）混合，離心，然后放入PCR儀中，在25℃下，反應10 min，然后在50℃下，反應1 h，最后在85℃條件下，反應5 min。將逆轉錄所得cDNA稀釋5倍，在-20℃冰箱中儲存備用。③實時熒光定量PCR 20 μL反應體系：9 μL SYBR Green Mix、7.4 μL ddH2O、2 μL cDNA、0.8 μL Reverse Primer（10 μmol/L）、0.8 μL Forward Primer（10 μmol/L）。本實驗中的內參基因選用β-actin。實驗中使用的所有引物均由生工生物工程上海有限公司合成并質譜檢測，β-actin的上游引物序列：5′-TGACGTGGACATCCGCAAA-3′，下游引物序列：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′;MTA1的上游引物序列：5′-CGCAGCCGTTGAATTTCTTG-3′，下游引物序列：5′-GCGGGACTTCTGTTGAGGC-3′。④實時熒光定量PCR反應。在RT-PCR儀中，將SYBR Green，cDNA產物以及引物混合進行擴增，以β-actin作為內參基因，反應條件為：95℃條件下預變性，反應10 min;95℃條件下變性，反應15 s;60℃條件下退火，反應1 min;95℃條件下變性，反應15 s和60℃條件下退火，反應1 min，重復40個循環，反應結束后，擴增結束。每個樣本做3個復孔。用2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0對所得數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺治療對大鼠OE%和OT%的影響

在EPM測試中，與空白組比較，模型組OE%和OT%明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05）;與模型組比較，電針兩穴組可顯著增加OE%和OT%，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），針刺兩穴組能增加OE%，差異有統計學意義（P < 0.05），而單穴位治療組作用效果不明顯，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1? ?針刺治療對大鼠OE%、OT%的影響（x±s）

注：與空白組比較，*P < 0.05;與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。OT%：開放臂停留時間比例;OE%：進入開放臂次數比例

2.2 針刺治療對大鼠CRH濃度的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬中CRH濃度顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與模型組比較，電針兩穴組與針刺兩穴組可明顯降低海馬中CRH濃度，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而單穴位治療組降低CRH濃度的趨勢不明顯，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

表2? ?針刺治療對大鼠CRH濃度的影響（nmol/L，x±s）

注：與空白組比較，**P < 0.01;與模型組比較，##P < 0.01。CRH：促腎上腺皮質激素釋放激素

2.3 針刺對大鼠CRH mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬中CRH mRNA的表達顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與模型組比較，電針兩穴組和針刺兩穴組可明顯降低海馬中CRH mRNA的表達，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），而單穴位治療組對CRH mRNA表達的影響不明顯，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

與空白組比較，**P < 0.01;與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01。CRH：促腎上腺皮質激素釋放激素

圖1? ?針刺對大鼠CRH mRNA表達的影響

3 討論

行為反映了個體所承受的外界刺激的特點，雖然人類與動物的行為活動不能完全對等，但其各自的行為活動與它們的心理及生理的關系十分密切。本研究所采用的EPM是國際公認的檢測動物焦慮行為的首選裝置[15]。本研究結果顯示，酒精戒斷大鼠可產生焦慮行為，其在開放臂的停留時間與空白組相比較短，進入開放臂的次數也相對較少。抗焦慮藥物可影響EPM的測試結果，該類藥物對嚙齒類動物的焦慮樣行為具有抑制作用[16]。目前，藥物治療是抗焦慮最為直接的治療方法，在臨床上，苯二氮■類藥物常用于治療酒精戒斷焦慮癥，雖取得了一定的療效，但隨著病情的不斷加重，病期的加長，口服藥量也會隨之相應增加，藥物的副作用也隨之產生。并且苯二氮■類藥物具有成癮性，其在臨床應用上受到了限制，所以研究和開發既無成癮性又有很好抗焦慮效應的新醫療手段是治療酒精依賴方面所面臨的緊迫任務。針灸具有療效穩固且無成癮性等優點，自古以來就被用于成癮藥物的脫敏、脫毒治療。在目前的研究中，電針兩穴、針刺兩穴治療可明顯改善酒精戒斷期間大鼠的焦慮樣行為，而單穴位治療作用效果不太明顯，說明針刺對焦慮的治療作用與針刺的方式、穴位有關。

大量的研究結果顯示，當機體受到內外環境的刺激時，應激反應會表現出一系列的神經內分泌物質的變化，主要表現為下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸的興奮。下丘腦室旁核是HPA-神經內分泌軸的中樞位點，CRH則是HPA軸激活的關鍵性物質。研究表明，在應激刺激下，CRH濃度以及CRH mRNA表達均顯著增加[17]。在焦慮癥狀中所觀察到的激素含量的變化主要是由CRH的過度分泌所導致的[18]。研究表明，CRH的受體拮抗劑可作為抗焦慮以及抗抑郁的神經藥理學治療方法[19]。邊緣系統具有生命腦、內臟腦、情緒腦的稱號，與學習、記憶以及情感等具有密切的關系，是較為高級的控制中樞，可作用于內臟與機體的內環境。海馬組織的傳入神經以及傳出神經的調節在成癮機制的形成、維持方面扮演著重要的角色。邊緣系統的主要組成部分之一便是海馬，它不僅可以控制并反映情緒，還與認知功能、焦慮作用關系密切[20]。由本研究結果可知，模型組大鼠的海馬中CRH濃度以及CRH mRNA表達較空白組大鼠均增加，經針刺治療后，其數值又趨于正常水平，由此提示，CRH在焦慮的發生中占有重要的地位。

綜上所述，本研究提示，針刺可緩解酒精戒斷期間的焦慮樣行為，其抗焦慮的作用機制可能與CRH濃度以及CRH mRNA表達有關。

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（收稿日期：2019-04-19? 本文編輯：張瑜杰）