甘草附子湯治療佐劑性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的抗滑膜血管生成機(jī)制研究

蔡悅 劉曉龍 郭靜 張囡

摘 要 目的：考察甘草附子湯通過抗滑膜血管生成途徑對佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）模型小鼠的治療作用機(jī)制。方法：取雄性Balb/c小鼠48只隨機(jī)分為正常組、模型組、甘草附子湯組和雷公藤多苷組（陽性藥物組），每組12只。除正常組外，其余小鼠左后足趾皮內(nèi)一次性注射弗氏完全佐劑以建立AA模型。造模12 d后，正常組、模型組小鼠灌胃相應(yīng)體積的水，甘草附子湯組（7.8 g/kg，以總生藥量計(jì)算）和雷公藤多苷組（0.01 g/kg）小鼠灌胃相應(yīng)藥液20 mL/kg，每天1次，連續(xù)18 d。觀察并記錄小鼠關(guān)節(jié)病變情況，并采用水容積法測量小鼠足腫脹度；采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化；采用免疫熒光法檢測小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的蛋白表達(dá)水平；采用Western blotting法檢測小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4（GATA4）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠足跖明顯紅腫，足腫脹度顯著升高（P<0.05）；踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，血管翳明顯增多，可見大量炎癥細(xì)胞及關(guān)節(jié)侵蝕等；滑膜組織中CD31、VEGF、NF-κB、GATA4的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，甘草附子湯組小鼠足跖紅腫現(xiàn)象減輕，足腫脹度顯著降低（P<0.05）；踝關(guān)節(jié)滑膜組織中血管翳有所減少，其他病理癥狀有所改善；滑膜組織中CD31、VEGF、NF-κB、GATA4的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：甘草附子湯可通過下調(diào)關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、NF-κB、GATA4蛋白的表達(dá)，減少滑膜組織中血管翳的形成并有效抑制血管新生，從而對AA模型小鼠發(fā)揮防治骨質(zhì)破壞、保護(hù)關(guān)節(jié)等作用。

關(guān)鍵詞 甘草附子湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；佐劑性關(guān)節(jié)炎；血管新生；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子；血管內(nèi)皮生長因子；鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4；核因子κB；小鼠

Study on Anti-synovial Angiogenesis Mechanism of Licorice and Aconite Decoction in the Treatment of Adjuvant Arthritis Model Mice

CAI Yue1，LIU Xiaolong2，GUO Jing3，ZHANG Nan4（1. Dept. of Rheumatology， the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM， Tianjin 300193， China； 2. Dept. of Hepatobilliary Surgery， Tianjin First Central Hospital， Tianjin 300192， China； 3. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM， Tianjin 300193， China； 4. School of Pharmacy， China Medical University， Shenyang 110003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the therapeutic effect of Licorice and aconite decoction in the treatment of adjuvant arthritis （AA） model mice through anti-synovial angiogenesis pathway. METHODS： Totally 48 male Balb/c mice were randomly divided into normal group， model group， Licorice and aconite decoction group and tripterygium glycosides group （positive drug group）， with 12 mice in each group. Except for normal group， AA model was established by intradermal injection of Freunds complete adjuvant into the left hind toe of mice. 12 d after modeling， normal group and model group were given same volume of water intragastrically； Licorice and aconite decoction group （7.8 g/kg，by total amount of crude drug） and tripterygium glycosides group （0.01 g/kg） were given relevant medicine 20 mL/kg intragastrically， once a day， for consecutive 18 d. The joint lesions of mice were observed and recorded， and the foot swelling degree of mice was measured by water volume method. HE staining was used to observe the pathological change of ankle joint in mice. The protein levels of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 （CD31） and vascular endothelial growth factor （VEGF） were determined by immunofluorescence assay. The protein expressions of nuclear factor κB（NF-κB） and zinc finger transcription factor GATA4 （GATA4） were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal group， ankle joint of model group mice was markedly reddened and swollen， and foot swelling degree increased significantly （P<0.05）. Synovial tissue of ankle joint proliferated， pannus increased significantly， and a large number of inflammatory cells and joint erosion were observed. The protein expression of CD31， VEGF， NF-κB and GATA4 in synovial tissue of mice were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the redness and swelling of ankle joint in mice were alleviated， and the foot swelling degree was significantly reduced in Licorice and aconite decoction group （P<0.05）. Pannus in synovial tissue decreased and other pathological symptoms were improved. The protein expression of CD31， VEGF， NF-κB and GATA4 were decreased significantly in synovial tissue （P<0.05）. CONCLUSIONS： Licorice and aconite decoction can decrease the protein expression of VEGF，NF-κB and GATA4 in synovial tissue， reduce the generation of pannus in synovial tissue and effectively inhibit the angiogenesis in synovial tissue so as to prevent bone destruction and protect joint of AA model mice.

KEYWORDS Licorice and aconite decoction； Rheumatoid arthritis； Adjuvant arthritis； Angiogenesis； CD31； VEGF； GATA4； NF-κB； Mice

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病；其全球患病率為0.5%～1%，臨床表現(xiàn)為對稱發(fā)作的關(guān)節(jié)腫脹、疼痛和持續(xù)晨僵等；其病理特征包括持續(xù)性滑膜炎、滑膜增生異常、血管生成和血管翳形成增加等，當(dāng)血管翳逐漸擴(kuò)展到關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨時(shí)，則會(huì)誘導(dǎo)軟骨和骨骼被逐漸破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1]。血管生成已被確定為RA疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志，并且通常被認(rèn)為是從急性炎癥期到慢性炎癥期的“轉(zhuǎn)換”標(biāo)志[2]。這是由于血管生成不僅可維持滑膜關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞群的擴(kuò)張，而且還可進(jìn)一步增強(qiáng)白細(xì)胞向組織中募集，導(dǎo)致炎癥加重；而炎癥狀態(tài)的滑膜細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生促血管生成因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)血管生成[3]。因此，抑制血管生成可能是RA臨床治療一種新思路[4]。

甘草附子湯收載于東漢張仲景的《傷寒論》，由甘草、附子、白術(shù)、桂枝組方而成，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、溫陽補(bǔ)中的功效，臨床上用于治療風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有較好的效果[5]。弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎（AA）模型是一種應(yīng)用廣泛的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，常用于預(yù)測藥物對RA的臨床療效[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草附子湯能明顯下調(diào)AA模型小鼠滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）和MMP-3的表達(dá)，降低其炎性細(xì)胞因子水平[7]。基于此，本研究擬進(jìn)一步探討甘草附子湯對AA模型小鼠滑膜組織中血管新生的影響，并通過檢測滑膜組織中血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4（GATA4）和核因子κB（NF-κB）的表達(dá)水平，探討甘草附子湯對AA模型小鼠的治療作用機(jī)制，以期為其用于臨床治療RA提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

YLS-7B型足趾容積測量儀（北京吉安得爾科技有限公司）；BX-51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ESP-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；Trans-Blot SD型槽式轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc MP型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)（無錫易純凈化設(shè)備有限公司）；HQ96型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；RM2265型切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

甘草附子湯（組方藥材炙甘草、炮附子、白術(shù)、桂枝飲片均購自天津同仁堂藥店，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅(jiān)教授鑒定為真品；制備過程：炙甘草、炮附子、白術(shù)、桂枝各15 g，以1.2 L水煎煮1 h，濾過，減壓濃縮，以水制成含總生藥量約390 mg/mL的藥液，4 ℃保存）；雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號：1211242063，規(guī)格：10 mg；使用時(shí)將其碾碎，以水制成含主藥為0.5 mg/mL 的混懸液）；鼠CD31單克隆抗體、兔VEGF多克隆抗體、兔NF-κB單克隆抗體、兔GATA4多克隆抗體、兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab119341、ab2349、ab109458、ab124265、ab8227）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號：100M8725）；驢抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗、驢抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為CA21202S、A-21206）；山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國CST公司，批號：7074）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、馬血清（美國Gibco公司）；蘇木精-伊紅（HE）染料試劑盒、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）、Triton X-100（北京索萊寶科技有限公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；水為無菌蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

8周齡Balb/c小鼠，雄性，體質(zhì)量為（18±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號SCXK（京）2014-0057，清潔級飼養(yǎng)。經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

取小鼠48只，隨機(jī)分為正常組、模型組、甘草附子湯組[7.8 g/kg（以總生藥量計(jì)算）；劑量根據(jù)成人臨床日常用量，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比換算]和雷公藤多苷組（陽性藥物組，0.01 g/kg[7]），每組12只。除正常組注射等體積生理鹽水外，其余組小鼠均于左后足趾皮內(nèi)一次性注射弗氏完全佐劑50 μL以建立AA模型[8]。以小鼠造模側(cè)、對側(cè)和前爪足跖明顯腫脹，受累關(guān)節(jié)畸形，行動(dòng)不便且體質(zhì)量明顯下降判定為造模成功。造模12 d后，剔除造模失敗的小鼠后，正常組、模型組小鼠灌胃水，甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為20 mL/kg，每天1次，連續(xù)18 d。

2.2 小鼠足腫脹情況觀察

分別在造模前和給藥結(jié)束時(shí)，觀察并記錄小鼠關(guān)節(jié)病變情況，同時(shí)采用水容積法測量小鼠右后足跖容積并計(jì)算足腫脹度[腫脹度（mL）=給藥結(jié)束時(shí)足跖容積-造模前足跖容積]。

2.3 小鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查

給藥結(jié)束后，斷頸處死小鼠，于無菌環(huán)境下取其右踝關(guān)節(jié)，石蠟包埋，切片（厚度：5 μm），脫水，HE染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化。

2.4 小鼠滑膜組織中CD31、VEGF蛋白表達(dá)水平檢測

采用免疫組織熒光法檢測。于無菌環(huán)境下各組取6只小鼠的右踝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，石蠟包埋，切片（厚度：5 μm）。參照相應(yīng)抗體說明書要求，分別將滑膜組織切片與CD31抗體（1 ∶ 100）或VEGF抗體（1 ∶ 500）置于含有1%馬血清、0.5%Triton X-100的PBS中，于4 ℃孵育過夜；切片以PBS洗滌后，置于驢抗小鼠二抗（1 ∶ 500，對應(yīng)CD31）或驢抗兔二抗（1 ∶ 500，對應(yīng)VEGF）中，于37 ℃避光孵育2 h；以PBS洗滌后，于熒光染色劑DAPI溶液（1 ∶ 1 000）中避光孵育5 min；PBS洗滌，稀甘油封片。在顯微鏡下進(jìn)行拍照，每張切片選取5個(gè)不重疊區(qū)域，鏡下觀察，以綠色熒光判斷為目標(biāo)蛋白陽性染色。采用 Image-Pro Plus 7.0軟件分析CD31蛋白陽性染色的單位面積光密度值（OD/μm2）和VEGF蛋白陽性染色面積占總面積的比值（%），用來表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.5 小鼠滑膜組織中NF-kB、GATA4蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blotting法檢測。于無菌環(huán)境下各組取6只小鼠的右踝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，加入5倍體積的裂解液混勻吹打后，置于冰盒中振蕩數(shù)秒；以12 000 r/min離心5 min，收集上清液，以BCA法測定蛋白含量。取蛋白樣品變性處理后，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，將PVDF膜分別置于NF-κB抗體（1 ∶ 1 000）或GATA4抗體（1 ∶ 1 000）中，4 ℃過夜；TBST緩沖液洗滌5 min×3次，將PVDF膜放入山羊抗兔標(biāo)記二抗（1 ∶ 2 000）中，搖床振搖孵育2 h后，以TBST緩沖液洗膜5 min×4次。ECL顯色劑顯影，采用凝膠成像儀檢測，采用Image Pro Plus 7.0軟件進(jìn)行圖像分析，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊則采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊則采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠足腫脹情況

除正常組外，其余各組小鼠造模側(cè)、對側(cè)和前爪足跖均有不同程度的紅腫，受累關(guān)節(jié)畸形；甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠足跖紅腫情況較模型組減輕。與正常組比較，模型組小鼠足腫脹度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠足腫脹度顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組小鼠足腫脹度檢測結(jié)果見表1（注：正常組小鼠由于體質(zhì)量增加，足跖體積也隨之略有增加）。

3.2 各組小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化

正常組小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨、骨組織未見破壞，滑膜襯里層的滑膜細(xì)胞排列有序，軟骨面均勻光滑，未見炎癥細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，少見血管翳；模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，血管翳明顯增多，結(jié)締組織可見大量的炎癥細(xì)胞，軟骨面較為粗糙，關(guān)節(jié)出現(xiàn)侵蝕；甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中血管翳有所減少，其他病理癥狀均有不同程度的改善。各組小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化顯微圖見圖1（注：箭頭指示位置為血管翳）。

3.3 各組小鼠滑膜組織中CD31、VEGF蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織中CD31、VEGF蛋白陽性染色熒光明顯增強(qiáng)，兩者表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠滑膜組織中CD31、VEGF蛋白陽性染色熒光明顯減弱，兩者表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而甘草附子湯組和雷公藤多苷組比較，上述蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠滑膜組織中CD31、VEGF蛋白表達(dá)熒光顯微圖見圖2、圖3（注：箭頭處為目標(biāo)蛋白的綠色熒光），蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

3.4 各組小鼠滑膜組織中NF-κB、GATA4的蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織中NF-κB、GATA4的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，甘草附子湯組和雷公藤多苷組小鼠滑膜組織中NF-κB、GATA4的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而甘草附子湯組與雷公藤多苷組比較，上述蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠滑膜組織中NF-κB、GATA4的蛋白電泳圖見圖4，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

4 討論

在臨床上，RA常采用非甾體類抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、生物制劑等進(jìn)行治療，這類藥雖可暫時(shí)緩解患者關(guān)節(jié)的腫痛，但不能有效抑制關(guān)節(jié)的破壞及控制病情進(jìn)展，且可能引發(fā)藥物性肝硬化或肝炎、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、繼發(fā)感染等不良反應(yīng)[9]。本研究采用的陽性對照藥雷公藤多苷片是目前公認(rèn)的治療 RA 的抗炎和免疫調(diào)節(jié)類中藥制劑，對腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等難治性或頑固性疾病療效顯著[10]。該藥起效快、療效確切[11]，但長期使用可導(dǎo)致肝毒性并影響男性生殖功能[12]。因此，研究者正努力尋找療效確切、副作用較少的RA治療藥物。RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“尪痹”等病證范疇，為風(fēng)寒濕侵入筋骨關(guān)節(jié)，營衛(wèi)不利，氣血凝澀，以筋骨劇痛拒按、不得屈伸為特征。甘草附子湯為治療痹證的經(jīng)典方劑，在臨床上有很長的應(yīng)用歷史，也有用于治療RA的報(bào)道[13]。考慮到AA 模型的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)特征和發(fā)病機(jī)制等方面與RA有許多相似之處[14]，因此本研究以該模型來研究甘草附子湯治療RA的可能作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用甘草附子湯干預(yù)治療AA模型小鼠可明顯減輕其足腫脹情況，減少其滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤，有改善其踝關(guān)節(jié)病理變化的作用。

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（收稿日期：2018-12-14 修回日期：2019-05-06）

（編輯：段思怡）