西咪替丁對低劑量率照射比格犬肝細胞凋亡的影響及其機制研究

王慶蓉 何穎 趙憶寧 沈先榮 劉玉明 李珂嫻 羅群 陳偉 侯登勇

摘 要 目的：研究西咪替丁對低劑量率照射比格犬肝細胞凋亡的影響及其機制。方法：將健康雄性比格犬隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性藥物組（香菇多糖，21.33 mg/kg）和西咪替丁低、中、高劑量組（5.33、10.67、21.33 mg/kg），每組4只。除正常對照組外，其余各組比格犬均予60Co-γ射線（劑量率：0.040 8 mGy/min）累積照射23 d，各給藥組于每日照射前口服相應藥物1次。停止照射24 h后，采用TUNEL法檢測各組比格犬肝細胞凋亡情況，并計算凋亡細胞百分比；采用免疫組化法檢測其肝組織中凋亡相關蛋白[Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、p53]的表達水平。結果：與正常對照組比較，模型對照組比格犬肝組織中凋亡細胞以及Bax、Caspase-3、p53陽性細胞均明顯增加，凋亡細胞百分比以及Bax、Caspase-3、p53蛋白表達水平均顯著升高；Bcl-2陽性細胞明顯減少，其蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型對照組比較，各給藥組比格犬肝組織中上述陽性細胞均有不同程度的變化，其中各給藥組凋亡細胞百分比和p53蛋白表達水平，陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組Bax蛋白表達水平以及西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低；西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高；且西咪替丁中、高劑量組凋亡細胞百分比以及西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著低于陽性對照組，西咪替丁低劑量組p53蛋白表達水平顯著高于陽性藥物組（P<0.05或P<0.01）。結論：西咪替丁可抑制低劑量率照射所致的比格犬肝細胞凋亡，對其具有一定的輻射保護作用。這種作用可能與上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達有關。

關鍵詞 西咪替丁；低劑量率輻射；肝臟；肝細胞凋亡；凋亡相關蛋白；比格犬；防輻射；機制

Effects of Cimetidine on Low Dose Rate Irradiation-induced Liver Cell Apoptosis in Beagle Dogs and Its Mechanism

WANG Qingrong，HE Ying，ZHAO Yining，SHEN Xianrong，LIU Yuming，LI Kexian，LUO Qun，CHEN Wei，HOU Dengyong（Dept. of Radiation Protection Medicine， Naval Medical Research Institute， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of cimetidine on low dose rate irradiation-induced liver cell apoptosis in Beagle dogs. METHODS： Healthy male Beagle dogs were randomly divided into normal control group， model control group， positive drug group （lentinan， 21.33 mg/kg） and cimetidine low-dose， medium-dose and high-dose groups （5.33， 10.67， 21.33 mg/kg）， with 4 Beagle dogs each. Except for normal control group， other groups were given 60Co-γ accumulative irradiation （dosage rate： 0.040 8 mGy/min） for 23 d； the medication groups were given relevant medicine orally before irradiation， once a day. Twenty-four hours after stopping irradiation， TUNEL method was used to detect the apoptosis of liver cells in Beagle dogs. The percentage of apoptotic cells was calculated. The expression level of apoptosis-related proteins （Bax， Bcl-2， Caspase-3， p53） in liver tissue was detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with normal control group， apoptotic cells and Bax， Caspase-3， p53 positive cells were increased significantly in liver tissue of Beagle dogs in model control group； the percentage of apoptotic cells， protein expression levels of Bax， Caspase-3 and p53 were increased significantly； Bcl-2 positive cells were decreased significantly， and its protein expression level was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model control group， above positive cells of liver tissue in Beagle dogs were changed to different extents in medication groups； the percentage of apoptotic cells and protein expression levels of p53 in medication groups， protein expression levels of Bax in positive drug group， cimetidine low-dose and high-dose groups as well as protein expression levels of Caspase-3 in cimetidine groups were decreased significantly； protein expression levels of Bcl-2 were increased significantly in cimetidine groups. The percentage of apoptotic cells in cimetidine medium-dose and high-dose groups as well as protein expression levels of Caspase-3 in cimetidine groups were all lower than positive control group. Protein expression level of p53 in cimetidine low-dose group was significantly higher than positive drug group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Cimetidine can inhibit the low dose rate irradiation-induced apoptosis of liver cells in Beagle dogs， and certainly protect liver cells against irradiation. The mechanism of it may be associated with up-regulating the protein expression of Bcl-2 and down-regulating the protein expression of Bax， Caspase-3 and p53 in liver cells.

KEYWORDS Cimetidine； Low dose rate irradiation； Liver； Liver cell apoptosis； Apoptosis-related proteins； Beagle dogs； Irradiation-resistance； Mechanism

隨著核能應用（涉及醫學、軍事、工業領域）的多樣化、普遍化，人們受到輻射損傷的風險也隨之升高。低劑量電離輻射（Low-dose radiation，LDR）可通過調節細胞信號轉導來改變多種基因和蛋白的表達，從而產生不同于大劑量照射且復雜多樣的生物效應[1-3]。近年來，LDR的健康效應受到了放射生物學家的極大關注，但由于其致機體損傷的作用機制尚存有爭議，故現有研究不多。西咪替丁是第一個用于臨床的H2受體拮抗藥，主要用于治療胃及十二直腸潰瘍、上消化道出血等疾病。隨著藥理學研究的不斷深入，研究者發現該藥具有許多不同于其他H2受體拮抗藥的新用途，如輻射防護作用[4-6]。本課題組前期研究了西咪替丁對LDR小鼠、大鼠和犬的防護作用，發現其對LDR模型動物的造血系統和抗氧化系統均具有較好的防護效果[7-9]。在此基礎上，本研究以對放射較敏感的肝臟為對象，重點觀察了西咪替丁對低劑量率照射（即長期累積劑量超過100 mGy，但劑量率低于5 mGy/h，更接近職業人群實際受輻射情況[10]）致比格犬肝細胞凋亡的保護作用以及對凋亡相關蛋白表達的調節作用，以期為闡明該藥防護LDR的作用機制、研發新型抗LDR藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；XSP-C204型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；5418R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；TB-214型精密電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

西咪替丁片（江蘇鵬鷂藥業有限公司，批號：1509241，規格：0.2 g）；香菇多糖片（陽性對照，浙江普洛康裕天然藥物有限公司，批號：150401，規格：基片重0.1 g）；兔源Bax多克隆抗體（武漢博奧森生物科技有限公司，批號：bs-0127R）；兔源p53多克隆抗體（美國OmnimAbs公司，批號：om267038）；兔源胱天蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、兔源Bcl-2多克隆抗體（英國Abcam公司，批號分別為Ab4051、Ab117115）；山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗、乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復液（pH 9.0）、山羊血清、蛋白酶K工作液、Harris蘇木精染色液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GB23303、G1203、G1208、G1205、G1004）；TUNEL檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：11684817910）；二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑（丹麥Dako公司，批號：K5007）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

普通級比格犬24只，雄性，體質量8～10 kg，由上海交通大學農學院教學實驗場提供[動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0005]。

2 方法

2.1 分組

所有比格犬均適應性喂養1周后，隨機分為6組，即正常對照組、模型對照組、陽性藥物組[香菇多糖，21.33 mg/kg；劑量參考犬體質量（12 kg）并按照該藥臨床成人劑量（800 mg/d）換算而得（換算系數為0.32，下同）]以及西咪替丁低、中、高劑量組[5.33、10.67、21.33 mg/kg，劑量參考犬體質量（12 kg）并分別按照該藥臨床成人劑量（200、400、800 mg/d）換算而得][11]，每組4只。實驗過程中，所有比格犬均單籠飼養，自由飲水，并喂以專用膨化飼料，每日2次。

2.2 照射與給藥

除正常對照組外，其余各組比格犬均予60Co-γ射線累積照射，劑量率為0.040 8 mGy/min，每日照射18 h，連續照射23 d（最后一天照射9 h）。各給藥組比格犬均于每日照射前給予相應藥物1次（將犬固定，用開口器將犬的數顆門齒固定好，將藥物放至比格犬舌根部，迅速閉合口腔，使犬自然吞咽服下藥物）；正常對照組和模型對照組比格犬不作任何處理。

2.3 樣本采集

當累積照射劑量接近1.0 Gy時（即連續照射23 d后），停止照射。于停止照射24 h后，靜脈注射3%戊巴比妥鈉對各組比格犬進行麻醉，解剖，取出其肝組織適量（約1 cm×1 cm×2 cm），置于10%甲醛溶液中固定2～3 d后，行常規石蠟包埋、切片（厚度約為3 ?m），備用。

2.4 肝細胞凋亡情況檢測

采用TUNEL法檢測比格犬肝細胞的凋亡情況。取“2.3”項下肝組織石蠟切片，脫蠟后置于水中，滴加蛋白酶K工作液適量，于37 ℃下孵育25 min；以pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，每次5 min；滴加TUNEL檢測試劑盒內試劑1和試劑2的混合溶液[即末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）-三磷酸脫氧尿苷（dUTP），體積比為1 ∶ 9]，于37 ℃下孵育2 h；以PBS洗滌3次，每次5 min，將樣本轉移至3%H2O2中，于室溫下避光孵育15 min，以PBS洗滌3次，每次5 min；經DAB顯色后，用水沖洗終止顯色；以Harris蘇木精染色液輕度復染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察（凋亡陽性細胞的細胞核內可見棕黃色顆粒）。每只犬每張切片隨機挑選6個視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0軟件進行圖像分析，并計算凋亡細胞百分比（凋亡細胞百分比=凋亡細胞數/總細胞數×100%）。

2.5 凋亡相關蛋白表達情況檢測

采用免疫組化法檢測比格犬肝組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53蛋白的表達情況。取“2.3”項下肝組織石蠟切片，脫蠟后置于水中，以EDTA抗原修復液進行修復，隨后加入3%H2O2以滅活內源性過氧化物酶，用10%山羊血清封閉30 min，分別滴加Bcl-2、Bax、Caspase-3、p53多克隆抗體（稀釋度均為1 ∶ 50），4 ℃孵育過夜；滴加HRP標記二抗（1 ∶ 1），常溫孵育50 min；以DAB顯色，Harris蘇木精染色液輕度復染，脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察（p53陽性細胞的細胞核呈棕黃色，其余蛋白陽性細胞的胞質內可見棕黃色顆粒）。每只犬每張切片隨機挑選6個視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0軟件對染色陽性區域進行分析，計算陽性細胞的累積光密度值（IOD）以表示凋亡相關蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗，采用Levene檢驗進行方差齊性檢驗。符合正態分布且方差齊的計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 肝細胞凋亡檢測結果

正常對照組比格犬肝組織中偶見凋亡細胞；停止照射后，與正常對照組比較，模型對照組比格犬肝組織中凋亡細胞明顯增加，其凋亡細胞百分比顯著升高，差異有統計意義（P<0.01）；與模型對照組比較，各給藥組比格犬肝組織中凋亡細胞均有所減少，其凋亡細胞百分比均顯著降低，且西咪替丁中、高劑量組顯著低于陽性藥物組，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見圖1、表1（圖中，“ []”所指為普通細胞，呈藍色；“ ”所指為相應凋亡細胞，呈棕黃色；下同）。

3.2 凋亡相關蛋白表達檢測結果

正常對照組比格犬肝組織中可見不同程度的Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53蛋白陽性染色；停止照射后，與正常對照組比較，模型對照組比格犬肝組織中Bax、Caspase-3、p53陽性細胞明顯增多、其蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2陽性細胞明顯減少、其蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；與模型對照組比較，各給藥組比格犬肝組織中凋亡相關蛋白的陽性染色情況均有不同程度的改變，其中陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組比格犬肝組織中Bax蛋白表達水平，西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達水平以及各給藥組p53蛋白表達水平均顯著降低，西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高；且西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達水平均顯著低于陽性藥物組，西咪替丁低劑量組p53蛋白表達水平顯著高于陽性藥物組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2～圖5、表1。

4 討論

體內外研究結果表明，西咪替丁具有較好的輻射防護作用，可能與其清除自由基、增加抗氧化酶表達及活性、調節機體免疫功能、保護造血功能等有關[5-6，12-13]，但其具體的作用機制尚不清楚。2002年，日本學者Kojima Y等[5]通過離體人外周血淋巴細胞試驗證實了西咪替丁對大劑量X射線誘導的淋巴細胞微核發生和細胞凋亡具有一定的抑制作用。細胞凋亡受多基因共同調控，如Bcl-2家族、Caspase家族、p53等。有研究表明，輻射可激活Caspase-3，并同時誘導Bax編碼基因的表達；p53參與輻射誘導的DNA損傷所致的凋亡過程，且其可被Bcl-2編碼基因抑制[14-15]。已有研究表明，抗氧化劑能保護輻射誘導的細胞凋亡，具有明顯的輻射防護效應[16]。西咪替丁具有較強的清除自由基、增強抗氧化酶表達及活性的作用，對大劑量X射線誘導的淋巴細胞凋亡具有保護作用[8，17-18]。隨著核能應用的日益廣泛，人們受到LDR（尤其是低劑量率照射）影響的概率要遠遠高于大劑量電離輻射，但目前有關LDR損傷防護藥物的研究卻十分有限：Mozdarani H等[19]報道了西咪替丁對低劑量快中子輻射損傷的防護作用；Jiang DW等[20]報道了西咪替丁對長期低劑量率中子和γ射線混合照射致大鼠輻射損傷的防護作用。因此，為進一步挖掘相關輻射防護藥物，有必要深入開展西咪替丁對LDR（尤其是低劑量率照射）防護作用的研究。

由于多糖具有較好的抗氧化、提高免疫力的作用，故近年來其抗輻射的作用也日益受到學者的關注。香菇多糖片為臨床常用藥物，主要用于慢性乙型遷延性肝炎和消化道腫瘤放化療的輔助治療，已有文獻報道了其對輻射損傷小鼠的防護作用[21]，因此本研究以香菇多糖片作為陽性對照藥物。肝臟是機體重要的代謝器官，也是對放射較敏感的器官之一，其放射敏感性弱于骨髓、淋巴組織、小腸、性腺、胚胎和腎[22]。本研究以低劑量照射比格犬肝臟為靶器官，以其肝細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達情況為指標，初步探討了西咪替丁的抗輻射作用及可能機制。

本研究結果顯示，以低劑量率連續照射23 d、累積劑量近1.0 Gy時，比格犬肝組織中可見明顯的凋亡細胞，其凋亡細胞百分比較正常對照組顯著升高。免疫組化試驗結果顯示，經低劑量率照射后，比格犬肝組織中Bax、Caspase-3、p53陽性染色細胞明顯增多，其蛋白表達水平均較正常對照組顯著升高；Bcl-2陽性染色細胞明顯減少，其蛋白表達水平顯著降低。這表明低劑量率（0.040 8 mGy/min）60Co-γ射線累積照射近1.0 Gy可導致比格犬肝細胞發生凋亡，造成一定程度的輻射損傷，且這種損傷與上調Bax、Caspase-3、p53蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達有關，這與已有文獻結果[23]基本相符。經西咪替丁預處理后，各給藥組比格犬肝組織中凋亡細胞均有不同程度的減少，其凋亡細胞百分比均顯著降低。免疫組化結果顯示，各給藥組比格犬肝組織中凋亡蛋白的表達均有不同程度的改變，其中陽性藥物組和西咪替丁低、高劑量組比格犬肝組織中Bax蛋白表達水平，西咪替丁各劑量組Caspase-3蛋白表達水平以及各給藥組p53蛋白表達水平均顯著降低；西咪替丁各劑量組Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高。這提示西咪替丁能有效抑制低劑量率照射所致的肝細胞凋亡，并減少Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達，促進Bcl-2蛋白的表達，與文獻報道的西咪替丁可促進腫瘤細胞凋亡[24-26]相矛盾。筆者推測這可能與西咪替丁對正常細胞和腫瘤細胞存在雙向調節作用有關，但具體作用機制尚不明確，有待進一步研究探討。此外本研究結果還顯示，西咪替丁中、高劑量組比格犬凋亡細胞百分比以及西咪替丁各劑量組比格犬肝組織中Caspase-3蛋白表達水平均顯著低于陽性藥物組，而西咪替丁低劑量組比格犬肝組織中p53蛋白表達水平顯著高于陽性藥物組。這提示高劑量西咪替丁對低劑量率照射比格犬肝細胞凋亡的抑制作用可能強于陽性對照藥物，而中、高劑量西咪替丁對Bax、Bcl-2、p53等凋亡相關蛋白表達的調控作用則與陽性藥物相當。

綜上所述，西咪替丁可抑制低劑量率照射所致的比格犬肝細胞凋亡，對其具有一定的輻射保護作用。這種作用可能與上調Bcl-2蛋白的表達，下調Bax、Caspase-3、p53蛋白的表達有關。但西咪替丁對LDR致損傷的保護作用分子機制及其抗凋亡的信號通路還有待后續深入研究。

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