金橘藥材的UPLC指紋圖譜建立、聚類分析及主成分分析

黃華花 王明軍 黃鳴清 呂詩詩 王圣江

摘 要 目的：建立金橘藥材的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并進行聚類分析和主成分分析。方法：采用UPLC法，色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，檢測波長為330 nm，進樣量為2 μL。以金柑苷峰為參照，繪制8批藥材樣品的UPLC指紋圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）進行相似度評價，確定共有峰；采用SPSS 24.0軟件對8批藥材樣品進行聚類分析和主成分分析。結果：8批藥材樣品的UPLC指紋圖譜有24個共有峰，相似度均大于0.97。聚類分析結果顯示，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類。經主成分分析，3個主成分因子的累計方差貢獻率為81.366%。結論：所建UPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結果可為金橘藥材的質量控制提供參考。

關鍵詞 金橘；超高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度評價；聚類分析；主成分分析

Establishment of UPLC Fingerprint， Cluster Analysis and Principal Component Analysis of Fortunella margarita

HUANG Huahua1，WANG Mingjun1，HUANG Mingqing2，LYU Shishi1，WANG Shengjiang1（1. Dept. of Pharmacy， Xiamen Medical College/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine/Fujian Provincial Key Lab of Traditional Chinese Medicine Finish Processing and Health Product Development， Fujian Xiamen 361023， China； 2. College of Pharmacy， Fujian University of TCM， Fuzhou 350122， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish UPLC fingerprint of Fortunella margarita， and to conduct its cluster analysis and principal component analysis. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was set at 330 nm， and sample size was 2 μL. Using fortunellin as reference， UPLC fingerprints of 8 batches of F. margarita were determined. The similarity of 8 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2012 edition） to confirm common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 24.0 software. RESULTS： There were 24 common peaks in UPLC fingerprints of 8 batches of sample，the similarity of which was higher than 0.97. Cluster analysis showed that 8 batches of samples were clustered into 2 categories. S1， S2， S3， S4， S6， S7 and S8 were clustered into one category； S5 was clustered into the other category. By principal component analysis， the accumulative contribution rate of three main components was 81.366%. CONCLUSIONS： Established UPLC fingerprint， the results of cluster analysis and principal component analysis can provide reference for quality control of F. margarita.

KEYWORDS Fortunella margarita； UPLC； Fingerprint； Similarity evaluation； Cluster analysis； Principal component analysis

金橘，別名金桔、山橘、金棗、金柑、金彈等，是蕓香科植物金橘[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]的果實，原產于我國，其中福建尤溪、廣西融安、廣西陽朔、江西遂川、湖南瀏陽和浙江寧波是金橘的六大產區[1]。金橘藥食同源，是一種營養價值較高的水果，同時也具有較高的藥用價值[2]。《中華本草》記載，金橘性溫，味辛、甘，具有理氣解郁、消食化痰、醒酒之功效，主治胸悶郁結、脘腹痞脹、食滯納呆、咳嗽痰多、傷酒口渴[3]。現代研究表明，金橘具有抑菌、抗氧化、調節免疫等作用[4-5]；除可直接食用或泡水飲用外，市面上還有咸金棗、金棗丹、金桔咀嚼片等相關制劑[6-7]。目前，金橘藥用方面的研究主要集中在成分分離和藥理活性方面[8-10]，未見質量控制方面的報道及相關質量標準。金橘藥材中許多成分的對照品在市面上購買不到，目前僅有金柑苷對照品和野漆樹苷對照品，但僅對一兩個成分進行含量測定并不能有效控制金橘藥材的整體質量。為此，本研究收集了我國主要產地的金橘藥材樣品，建立了其超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并結合聚類分析和主成分分析進行綜合質量評價，旨在為有效控制其質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity型 UPLC儀，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、二極管陣列檢測器、Empower? 3色譜工作站（美國Waters公司）；BS224S型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

金柑苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Q14M10Q73839，純度：>98%）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金橘（編號：S1～S8）經廈門醫學院藥學系鮑紅娟副教授鑒定為金橘[Fortunella margarita （Lour.） Swingle]的果實。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%A→40%A；20～25 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：330 nm；進樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取金柑苷對照品適量，精密稱定，加75%甲醇溶解，制成質量濃度為24.6 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品適量，粉碎，過40目篩，取0.5 g，精密稱定，置于具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率：900 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S4）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以金柑苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，24個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.10%（n=6），相對峰面積的RSD均小于1.92%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以金柑苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，24個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.28%（n=7），相對峰面積的RSD均小于2.84%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取藥材樣品（編號：S4）0.5 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以金柑苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，24個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.15%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.90%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關分析

2.4.1 UPLC指紋圖譜的生成 取8批藥材樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）對8批藥材樣品指紋圖譜進行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版），以藥材樣品的UPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，8批藥材樣品的相似度均大于0.97，提示藥材樣品的化學成分一致性較好，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 8批藥材樣品共有24個共有峰，通過與對照品溶液的UPLC圖（見圖3）比對，指認23號峰為金柑苷峰。因該峰分離度良好、峰面積大且穩定，故以其保留時間和峰面積為參照，計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4。

2.5 聚類分析

以各共有峰的峰面積除以稱樣量的數值作為原始數據，采用SPSS 24.0軟件，以組間聯接法結合平方歐氏距離對8批藥材樣品進行聚類分析，詳見圖4。由圖4可知，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類。

2.6 主成分分析

對8批藥材樣品的24個共有峰的絕對峰面積進行標準化處理后，采用SPSS 24.0軟件進行主成分分析，其特征值和方差貢獻率結果見表5。由表5可知，共得到3個主成分因子，特征值分別為10.736、6.067、2.725，方差貢獻率分別為44.732%、25.280%、11.353%，累計方差貢獻率為81.366%。這提示，主成分因子1、2、3可作為金橘藥材的評價指標，適用于主成分分析。故取主成分因子1、2、3為指標對8批藥材樣品進行評價，詳見表6、圖5。結果顯示，8批藥材樣品中S1～S4、S6～S8樣品質量較為相近，與S5質量差異較大。

3 討論

現代研究表明，金橘具有抗炎鎮痛、鎮咳祛痰、免疫調節、預防結石、解酒保肝等作用[11-14]，其主要有效成分為黃酮類成分[12，15]。也有研究發現，金橘中所含的黃酮類成分包括金柑苷、柚皮素、根皮苷、野漆樹苷、4′-甲氧基-牡荊素-2″-O-α-L-鼠李糖苷、4′-甲氧基-異牡荊素- 2″-O-α-L-鼠李糖苷、蘆丁等[16-18]。筆者參考上述文獻，發現金柑苷為金橘的特征性成分之一，因此選擇金柑苷作為參照峰建立金橘藥材的UPLC指紋圖譜。

本試驗比較了乙腈-水、甲醇-水的流動相體系，發現兩種體系中各組分分離度均較好，但采用乙腈-水流動相體系時出峰較快，因此初步選出乙腈-水為流動相體系。但試驗過程中發現，檢測一段時間后，色譜峰出現了拖尾現象，而再加入0.1%磷酸可使峰形改善且穩定，故最終確定乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。筆者又比較了267、330 nm波長下樣品的色譜行為，發現在330 nm波長下基線較平穩，色譜峰較多，各峰的峰高合適，故選擇330 nm為檢測波長。

采用50%、75%、100%甲醇分別對樣品進行提取時，發現得到的色譜峰及各峰面積差異不大，但50%甲醇提取時的樣品溶液濾過困難，又考慮到環保因素，最終選擇75%甲醇為提取溶劑。同時，筆者又考察了不同提取時間（15、30、45 min）對提取效果的影響，結果發現，提取30 min時的提取效果較提取15 min好，提取45 min時與提取30 min無顯著差異，故選擇提取時間為30 min。

相似度評價結果顯示，8批藥材樣品的相似度均大于0.97，表明藥材樣品的化學成分一致性較好；8批樣品24個共有峰的相對保留時間的RSD范圍為0～0.31%，相對峰面積的RSD范圍為0～66.36%，表明不同產地間藥材樣品雖具有相同的化學成分，但含量存在差異。聚類分析、主成分分析結果均顯示，8批藥材樣品可聚為兩類，S1～S4、S6～S8聚為一類，S5聚為一類，表明8批藥材樣品中S1～S4、S6～S8樣品質量較為相近，與S5質量差異較大。該結果與相似度評價結果一致，其原因可能與藥材的產地、采集時間、植株生長年份不同有關。

綜上所述，本研究所建UPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結果可為金橘藥材的質量控制提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 鄭潔，江東，張耀海，等.我國主要金柑品種果皮中揮發性成分比較[J].食品科學，2015，36（6）：145-150.

[ 2 ] 李麗，盛金鳳，孫健，等.金桔的營養價值及綜合利用現狀與前景[J].食品工業，2015，36（9）：220-224.

[ 3 ] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第四卷[M].上海：上海科學技術出版社，1999：936.

[ 4 ] 項娟娟.金桔膠囊抗炎鎮痛、鎮咳祛痰和免疫增強的藥理學作用[J].中國藥房，2014，25（11）：1003-1005.

[ 5 ] 黎繼烈，崔培梧，吳耀輝，等.金橘黃酮對小鼠抗氧化作用的研究[J].時珍國醫國藥，2009，20（5）：1031-1032.

[ 6 ] 鄭正男，丁利君，鄭希，等.梅子風味金棗丹的加工工藝技術研究[J].食品工業，2016，37（1）：160-163.

[ 7 ] 零東寧，何雪梅，孫健，等.金桔咀嚼片加工工藝的研究[J].輕工科技，2015（8）：12-13.

[ 8 ] 孟猛.金柑檸檬苦素類化合物的提取純化、結構鑒定及生物活性研究[D].福州：福建農業大學，2013.

[ 9 ] 陳萍，婁東華，王建剛.金橘揮發性成分的SPME-GC/MS分析[J].食品研究與開發，2011，32（12）：140-142.

[10] 劉順珍，劉紅星，張麗霞，等.金橘葉和金橘果皮揮發油成分的分析[J].安徽農業科學，2011，36（26）：15968-15972.

[11] 白婕.金橘化學成分及抗氧化作用初步研究[D].長沙：中南林業科技大學，2007.

[12] 黎繼烈，王衛，劉忠敏，等.金橘黃酮對小鼠免疫功能的影響[J].時珍國醫國藥，2009，20（7）：1599-1600.

[13] 余志運，石洪波，張雪軍，等.金桔液預防草酸鈣腎結石的實驗與臨床研究[J].臨床泌尿外科雜志，2005，20（9）：543-545.

[14] 陳則夷.金柑解酒保肝組分功效研究[D].長沙：湖南農業大學，2012.

[15] 唐巧玉，周毅峰，朱玉昌，等.金橘皮中黃酮類物質的提取及其體外抗氧化活性研究[J].農業工程學報，2008，24（6）：258-261.

[16] 田圣梅.蕨菜和金橘果實化學成分的研究[D].合肥：安徽大學，2011.

[17] 葛永斌.金橘化學成分研究[J].中藥材，2014，37（3）：435-438.

[18] 王治元，李寧，王開金，等.金橘果皮的化學成分[J].植物資源與環境學報，2010，19（1）：92-94.

（收稿日期：2019-01-10 修回日期：2019-04-23）

（編輯：陳 宏）